李志士,劉鐵梅

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林長春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院輸血科,吉林長春 130033)

基因芯片檢測輸血傳播病毒方法的實(shí)驗(yàn)研究

李志士1,劉鐵梅2

(1.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,吉林長春 130021;2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院輸血科,吉林長春 130033)

目的建立基因芯片快速檢測經(jīng)輸血傳播病毒核酸的方法,進(jìn)而探討該方法用于檢測臨床標(biāo)本的可行性。方法通過PCR獲得TTV病毒ORF1基因的DNA片段,克隆,從重組質(zhì)粒擴(kuò)增DNA片段,并點(diǎn)到玻璃載體上,制成芯片。與TTV病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及戊型肝炎等病毒的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交,以檢測探針的特異性。結(jié)果該基因芯片探針僅與TTV毒株的PCR產(chǎn)物雜交呈陽性,與對照病毒的PCR產(chǎn)物雜交呈陰性。敏感性試驗(yàn)顯示,用該方法檢測了27份疑似TTV臨床病料,22份陽性;而用PCR法擴(kuò)增TTV ORF1基因確診為陽性的只有19份。結(jié)論利用基因芯片檢測TTV的PCR產(chǎn)物,特異性和敏感性強(qiáng),可作為TTV臨床標(biāo)本檢測方法。

經(jīng)輸血傳播病毒;基因芯片;檢測

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0887)

輸血傳播病毒(TTV)最早由Nishizawa等1997年從1例不明原因的輸血后非甲-庚型肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)[1]。TTV是已知的環(huán)病毒科中唯一感染人類的病毒[1]。目前檢測TTV感染所采用的方法是血清巢氏PCR法。本研究通過PCR法擴(kuò)增TTV核酸最保守部分ORF1基因的DNA片段,克隆,從重組質(zhì)粒擴(kuò)增DNA片段,并點(diǎn)到玻璃載體上,制成芯片,檢測TTV的PCR產(chǎn)物。對芯片探針的基因序列分析證明其核苷酸序列具有高度的保守性,理論上可用于TTV不同血清型的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

肝組織與血清標(biāo)本長春地區(qū)的TTV陽性患者。肝穿刺活檢或手術(shù)切除的肝組織標(biāo)本立即用10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋切片。采用經(jīng)高壓滅菌處理的一次性帶蓋試管,手術(shù)或肝穿刺前空腹抽取靜脈血10 ml,離心分離血清,分裝后-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與試劑

MicroGrid TAS型芯片點(diǎn)樣儀(BioRobotics公司)、384孔板、Personal 4100A型芯片掃描儀(GenePix公司)、Biofuge stratos臺式高速離心機(jī)(Kendro公司)、GenePix4.1軟件(GenePix公司)。主要試劑Taq DNA聚合酶購自上海生工;PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自v-gene生物科技有限公司;dNTP購自Promega公司;、pMD18-T Vector購自大連寶生物工程有限公司;鮭魚精DNA購自Sigma公司,高純度病毒核酸提取試劑盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit,Roche Molecular Biochemicals產(chǎn)品)。

1.3 引物設(shè)計(jì) 分析GenBank上登錄TTV多個毒株ORF基因保守序列,寡核苷酸引物用Oligo,version 4.1設(shè)計(jì),并在GenBank中分析序列的匹配情況。設(shè)計(jì)好的引物由寶生物技術(shù)有限公司(大連)合成, 其中1號序列1A引物5'端進(jìn)行HEX修飾(表1)。

1.4 用于點(diǎn)樣DNA片段的制備

DNA的抽提 采用高純度病毒核酸提取試劑盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit,Roche Molecular Biochemicals產(chǎn)品),參照說明進(jìn)行。分別使用 2、3、4、5號引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳分析并回收DNA片段,分別進(jìn)行pMD18-T Vector重組連接,將DNA片段的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含有X2Gal、IPTG、Amp的L2瓊脂平板培養(yǎng)基上挑選白色菌落進(jìn)行篩選。參照堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA[4]。進(jìn)行DNA片段序列測定分析,序列測定由寶生物工程(大連)有限公司完成。通過質(zhì)粒PCR,無水乙醇沉淀,獲得高濃度捕捉DNA。

1.5 制備芯片

分別提取上述4種DNA片段的重組質(zhì)粒,用特異性引物2、3、4、5分別對這4種DNA片段的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為排除載體序列對體系的干擾,PCR產(chǎn)物需經(jīng)切膠回收,純化,然后將純化產(chǎn)物定量,以100 ng/μ L的濃度按圖1進(jìn)行點(diǎn)樣,其中芯片列陣中A號位點(diǎn)為陽性坐標(biāo)探針,其序列為:5'-cy3-ggtcactcgttacgaacgc-3',5'端使用cy3進(jìn)行熒光修飾,2/3/4/5為編號2、3、4、5引物相對應(yīng)的PCR產(chǎn)物,0號為空白對照,芯片點(diǎn)樣完畢,經(jīng)80℃干烤2 h,完成基因芯片的制備。

圖1 探針在芯片上的點(diǎn)樣位置

1.6 樣品處理和雜交

采用高純度病毒核酸提取試劑盒提取病毒基因組織DNA,參照說明進(jìn)行。使用帶有熒光標(biāo)記的1號引物對基因組DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),制備探針,經(jīng)純化和濃度測定,-20℃避光保存?；蛐酒?jīng)95℃變性,加入25 μ L預(yù)雜交液,44℃預(yù)雜交1 h。加入25μ L雜交液,雜交液含探針(終濃度為2 ng/μ L),42℃雜交8 h,芯片洗滌后以基因芯片掃描儀掃描分析,出現(xiàn)明顯可見的雜交信號(斑點(diǎn))判為陽性。

1.7 基因芯片的驗(yàn)證及臨床樣品的檢測

依照上述樣品處理和雜交方法,對TTV病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及戊型肝炎等病毒陽性樣品及27份疑似TTV臨床病料進(jìn)行PCR反應(yīng),產(chǎn)物檢測標(biāo)記探針同制備的芯片進(jìn)行雜交分析。雜交程序以上述規(guī)范方法進(jìn)行,掃描分析后以BMP格式圖像判定檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 探針DNA片段的克隆及鑒定結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),應(yīng)用 PCR方法對TTV病毒ORF1基因片段進(jìn)行擴(kuò)增,獲得了4個芯片點(diǎn)樣用DNA片段及重組DNA片段質(zhì)粒。PCR產(chǎn)物電泳(圖2)鑒定可以看出,均得到了與目的片段相符的條帶?；蚱未笮≡?80-200 bp。

2.2 基因芯片的制備結(jié)果

用特異性引物2、3、4、5分別對這4種DNA片段的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物需經(jīng)切膠回收,純化,然后將純化產(chǎn)物定量,以100 ng/μ L的濃度進(jìn)行點(diǎn)樣,芯片點(diǎn)樣完畢后,編號,經(jīng)80℃干烤2 h,完成基因芯片的制備。試驗(yàn)設(shè)計(jì)基因芯片為6×5陣列,其中陣列第一排與第一列為陽性坐標(biāo)探針,第二、三、四、五排為TTV檢測探針,第六排為陰性對照,圖3為芯片點(diǎn)樣后陽性坐標(biāo)探針掃描結(jié)果。

圖2 PCR檢測結(jié)果

2.3 陽性樣品處理和雜交

使用編號為1的引物對已知陽性TTV病毒進(jìn)行PCR擴(kuò)增,之后與芯片進(jìn)行雜交,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)探針同已知陽性TTV病毒進(jìn)行PCR產(chǎn)物可特異性雜交,制備的芯片可檢測出TTV病毒ORF1基因片段。(見圖4)

圖3 基因芯片的制備結(jié)果

圖4 陽性樣品檢測結(jié)果

2.4 基因芯片的驗(yàn)證及臨床樣品的檢測

對TTV病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及戊型肝炎等病毒陽性樣品及27份疑似TTV臨床病料進(jìn)行PCR反應(yīng),產(chǎn)物檢測標(biāo)記探針同制備的芯片進(jìn)行雜交分析。結(jié)果顯示,芯片可以對TTV病毒進(jìn)行特異性檢測,針對甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及戊型肝炎等病毒檢測時沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果。應(yīng)用制備的芯片對長春地區(qū)27份疑似TTV臨床病料進(jìn)行檢測,22份陽性;而用PCR法擴(kuò)增TTV ORF1基因確診為陽性的只有19份。表明此方法的敏感性高于普通PCR檢測方法。

3 討論

本研究進(jìn)行了TTV核酸診斷基因芯片的制備及其檢測技術(shù)的研究,克隆和鑒定了TTV ORF1基因DNA片段,成功制備了TTV核酸診斷基因芯片,并進(jìn)行了制備基因芯片的檢驗(yàn)研究;建立了基因芯片診斷TTV核酸的檢測技術(shù)。該檢測技術(shù)可以靈敏特異地對TTV病毒進(jìn)行檢測,具有檢測靈敏性好、特異性高和芯片可重復(fù)檢測的優(yōu)點(diǎn)。

1997年日本學(xué)者Nishizawa首次報道分離出TTV,國內(nèi)學(xué)者隨后也相繼報道了相關(guān)人群中TTV的感染情況。業(yè)已證實(shí)TTV是一種單鏈DNA病毒,基因全長約3.7 kb,有2個開放讀碼框架(ORF)。目前,臨床上TTV診斷主要依據(jù)PCR方法,但其靈敏性還有一定的局限性。上世紀(jì)九十年代出現(xiàn)的DNA芯片技術(shù)則具備可以對成百上千、甚至上萬個基因進(jìn)行同時檢測的優(yōu)勢,具有高通量和并行化特點(diǎn)[2,3]。目前該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、疾病診斷、基因多態(tài)性分析、發(fā)現(xiàn)新基因及藥物篩選等研究領(lǐng)域,特別是在疾病診斷方面已獲得許多成功[4-6]。應(yīng)用基因芯片技術(shù)可以在基因水平同時確定多個病原遺傳物質(zhì)的存在,提供一種處理一次樣品診斷鑒診斷的新方法,隨著新技術(shù)方法的不斷出現(xiàn)普及,基因芯片檢測方法將會在臨床檢測中不斷應(yīng)用[7,8]。本研究,在基因芯片載體上檢測TTV病毒ORF1 DNA片段,實(shí)驗(yàn)證明,這一思路是可行的,由于DNA芯片技術(shù)則具備可以對成百上千、甚至上萬個基因進(jìn)行同時檢測的優(yōu)勢,在此基礎(chǔ)之上可以在芯片平臺上不斷增加探針,進(jìn)而可以將甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒及戊型肝炎等病毒的特異性探針集成在一張芯片上,建立高通量的肝炎病毒檢測方法。使臨床肝炎病毒的檢測變得更加方便。

[1]Nishizawa T,Okamoto H,Konishi,et al.A novel DNA virus(TTV)asso-ciated with elevated transaminase levels in post transfusion hepatitis of unknown etiology[J].B iophys Rescommun,1997,241(1):922.

[2]Pease A C,Solas D,Sullivan E J,Cronin M T,Holmes C P,Fodor SP A.Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences USA,1994,91:5022.

[3]Schena M,Shalon D,Davis R W,Brown P O.Quantitativemonitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray[J].Science,1995,270:467.

[4]Bowtell D D L.Options available-from start to finish-for obtaining expression data by microarray[J].Nature Genetics,1999,21:25.

[5]Duggan,D J,BittnerM,Chen Y D,Meltzer P,Trent J M.Expression profiling using cDNA microarrays[J].Nature Genetics,1999,21:10.

[6]Debouck C,Goodfellow P N.DNA microarrays in drug discovery and development[J].Nature Genetics,1999,21:48.

[7]Favis R,Day J P,Gerry N P,PhelanC,Narod S,Barany F.Universal DNA array detection of small insertions and deletions in BRCA1 and BRCA2[J].Nature Biotechnology,2000,18:561.

[8]Shalon D,Smith S J,Brown P O.A DNA microarray system for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hybridization[J].Genome Research,1996,6(7):639.

Detection of transfusion transmitted virusgene chip method of experimental study

LI Zhi-shi1,LIUTie-mei2.(1.The Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun130021,China;2.China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun130033,China)

ObjectiveTo establish the gene chipmethod of rapid detection of TTV DNA,and then explore the method used to detect the feasibility of clinical samples.MethodsTTV virus OR F1 gene PCR to obtain the DNA fragments,cloning,DNA fragments amplified from the recombinant plasmid,and point to the glass carrier,made of silicon.And TTV virus,hepatitis A virus,hepatitis B virus and hepatitis E virus like PCR products were hybridized to detect the probe specificity.ResultsThe results of the gene-chip probe only with TTV strains positive for PCR product of hybridization with the control virus and organizations PCR product of hybridization were negative.Sensitivity tests showed thatUsing thismethod to detect clinical disease,27were suspected of TTV material,22 were positive;but with the TTV ORF1 gene was amplified by PCR confirmed positive,only 19 copies.ConclusionThe detection of TTV DNA microarray of the PCR product specificity and sensitivity of strong,repeatable,can be used as clinical samplesTTV detection methods.

transfusion transmitted virus;gene chip;Detection

Q78

A

1007-4287(2010)06-0887-04

2009-05-19)