張松靈,李春紅,魏振彤,田海涵

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林長(zhǎng)春 130021;2.通遼市紅星醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古通遼 028007)

LIFR在原發(fā)不孕癥患者子宮內(nèi)膜的表達(dá)

張松靈1,李春紅1,魏振彤1,田海涵2

(1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科,吉林長(zhǎng)春 130021;2.通遼市紅星醫(yī)院婦產(chǎn)科,內(nèi)蒙古通遼 028007)

目的探討白血病抑制因子受體(Leukaemia inhibitory factor receptor,LIFR)在子宮內(nèi)膜的表達(dá),與原因不明原發(fā)不孕癥的關(guān)系。方法采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù),檢測(cè)30例研究組(原因不明原發(fā)不孕癥患者)和20例對(duì)照組患者分泌中期子宮內(nèi)膜LIFRmRNA的表達(dá)。結(jié)果研究組分泌中期子宮內(nèi)膜LIFRmR NA表達(dá)水平為0.640 1±0.234 9,對(duì)照組為 1.558 7±0.296 1,研究組較對(duì)照組明顯降低,差異有極顯著性(P＜0.001)。結(jié)論LIFR表達(dá)減少或缺失,可能與原因不明原發(fā)不孕癥有關(guān)。

子宮內(nèi)膜;白血病抑制因子受體;卵植入;不孕癥

(Chin J Lab Diagn,2010,14:0881)

白血病抑制因子受體(Leukaemia inhibitory factor receptor,LIFR)是LIF的低親和性受體,LIF需與受體結(jié)合后方可產(chǎn)生生物活性。但是關(guān)于LIFR與著床的關(guān)系目前尚無(wú)明確報(bào)道,它與原因不明原發(fā)不孕癥的關(guān)系亦不可知。本實(shí)驗(yàn)旨在研究LIFR在原因不明原發(fā)不孕癥婦女子宮內(nèi)膜的表達(dá)情況,以探究LIFR與原因不明原發(fā)不孕癥患者著床失敗之間的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料來(lái)源

研究組(原因不明原發(fā)不孕癥患者組)30例,均為2006年5月至2008年09月在吉林大學(xué)第一醫(yī)院及吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診的患者。不孕時(shí)間2-7年,年齡22-36歲,平均年齡29歲,月經(jīng)規(guī)律,無(wú)痛經(jīng),月經(jīng)周期26-35 d,平均月經(jīng)周期32天,基礎(chǔ)體溫雙相(高相期14 d),性激素6項(xiàng)水平均在正常范圍內(nèi),婦科B型超聲檢查盆腔的子宮及附件正常。輸卵管通暢試驗(yàn)證實(shí)輸卵管通暢。丈夫精液檢查正常,雙方抗精子抗體陰性。B超監(jiān)測(cè)見(jiàn)成熟卵泡突然消失或縮小,抽血檢測(cè)E2＞1 100 pmol/L,血LH 34-78 IU/L,即確定該日為排卵日。于排卵日后8-10 d即分泌中期行診斷性刮宮,刮出的子宮內(nèi)膜一份立即放入-70℃冰箱中保存,另一份子宮內(nèi)膜行病理檢查,證實(shí)呈分泌期改變。對(duì)照組20例,均為正常受試者,年齡26-38歲,平均年齡32歲,已有生育史,月經(jīng)規(guī)律,無(wú)痛經(jīng),月經(jīng)周期26-35 d,平均月經(jīng)周期30天,基礎(chǔ)體溫雙相(高相期14 d),性激素6項(xiàng)水平在正常范圍,B超監(jiān)測(cè)見(jiàn)成熟卵泡突然消失或縮小,抽血檢測(cè)E2＞1 100 pmol/L,血LH 34-78 IU/L,即確定該日為排卵日。于排卵日后8-10 d即分泌中期行診斷性刮宮,刮出內(nèi)膜一份立即放入-70℃冰箱中保存,另一份內(nèi)膜行病理檢查,證實(shí)呈分泌期改變。兩組患者3個(gè)月內(nèi)均未服用可引起性激素變化的藥物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取與鑒定:每例患者取50 mg內(nèi)膜組織,采用動(dòng)物總RNA提取試劑盒抽提RNA(試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司)。提取的RNA樣品在波長(zhǎng)260 nm和280 nm處的吸光度(A)比值(A260/A280)保持在1.772-1.985之間,符合蛋白污染容許容量(1.7-2.0),根據(jù)A值計(jì)算出總RNA濃度。

1.2.2 LIFR引物 cDNA 序列[1],上游:5′-CAAAAGAGTGTCTGTGAG-3′, 下 游:5′-CCATGTATTTACATTGGC-3′,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為459 bp。由于 β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)在所有組織中均呈高水平恒定表達(dá),選其作為內(nèi)對(duì)照,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為300 bp。

1.2.3 LIFRmRNA表達(dá)的測(cè)定:采用一步法RT-PCR技術(shù)檢測(cè)LIFRmRNA的表達(dá)(北京鼎國(guó)試劑盒),進(jìn)行35個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增:94℃變性1 min,58℃退火1 min,72℃延長(zhǎng)2 min。最后72℃延長(zhǎng)10 min。

1.2.4 PCR產(chǎn)物測(cè)定:PCR反應(yīng)產(chǎn)物8 μ l加溴芬藍(lán)4 μ l在 2%瓊脂糖凝膠中電泳 20 min(100 V),紫外觀測(cè)儀下攝影,凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描各電泳帶的灰度值,計(jì)算LIFR與β-actin灰度值的比值,即為子宮內(nèi)膜LIFRmRNA表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

研究組30例原發(fā)不孕癥患者分泌期中期子宮內(nèi)膜LIFRmRNA表達(dá)水平為1.558 7±0.296 1(圖1),對(duì)照組20例分泌期中期子宮內(nèi)膜LIFRmRNA表達(dá)水平為0.640 1±0.234 9(圖2),均以β-actin灰度值為參照,t=11.63,研究組較對(duì)照組分泌期中期子宮內(nèi)膜LIFRmRNA表達(dá)水平明顯降低,差異有顯著性(P＜0.001)。兩組患者平均年齡對(duì)照組稍高,平均月經(jīng)周期研究組稍長(zhǎng),但差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。

圖1 研究組LIFRmRNA

圖2 對(duì)照組LIFRmRNA

3 討論

LIF調(diào)節(jié)著床的直接證據(jù),來(lái)源于LIF基因突變小鼠[2],利用同源重組法獲得LIF缺陷的純合子小鼠,雌鼠能產(chǎn)生成活胚泡,但不能著床并進(jìn)一步發(fā)育。當(dāng)將這些胚胎移植到野生型小鼠子宮后,則可正常著床并發(fā)育成熟。而部分原因不明原發(fā)不孕癥患者均出現(xiàn)受精卵著床失敗,因此人們聯(lián)想到LIF與原因不明原發(fā)不孕癥的關(guān)系。LIFmRNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯,主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中完成,然后合成的蛋白分泌到子宮腔中發(fā)揮作用[3,4],采用免疫染色法檢測(cè)到LIF在子宮內(nèi)膜腔腺上皮中均表達(dá)。而且隨月經(jīng)周期其表達(dá)量也出現(xiàn)波動(dòng),高峰出現(xiàn)在黃體中晚期即“種植窗”時(shí)期,在妊娠早期人子宮內(nèi)膜及蛻膜中表達(dá)量仍較高。從正常可孕婦女子宮沖洗液中可獲得大量的LIF表達(dá),而且于月經(jīng)周期分泌中晚期表達(dá)增高。

然而近年來(lái)研究表明:LIF在原因不明原發(fā)不孕癥患者子宮內(nèi)膜內(nèi)的表達(dá),較正常人減弱甚至缺失,證明LIF是妊娠助孕因子,它表達(dá)的缺失可能與不孕癥的發(fā)病有關(guān)[5,6]。LIFR是LIF受體復(fù)合物中的低親和性受體,系由LIFRα及LIFRβ兩條鏈構(gòu)成。另外,LIF還有一個(gè)高親和性受體gp130。研究證明,LIF需先以較低親和力與受體LIFR結(jié)合,然后與gp130相互作用形成親和力高的復(fù)合物從而發(fā)揮一系列的生物活性。LIFR主要分布于子宮內(nèi)膜上皮[7],與LIF一樣在整個(gè)月經(jīng)周期內(nèi)均表達(dá),與圍著床期升高。但對(duì)于LIFR在不孕癥婦女子宮內(nèi)膜內(nèi)的表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外卻未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)原因不明原發(fā)不孕癥婦女子宮內(nèi)膜分泌中期LIFR的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)原因不明原發(fā)不孕癥患者子宮內(nèi)膜分泌中期LIFR的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯下降甚至缺失,差異有顯著性。雖然究竟是什么原因使LIFR的表達(dá)減弱或缺失尚不得知,但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們不孕癥患者子宮內(nèi)膜內(nèi)LIF及其受體LIFR的表達(dá)均減少。那么究竟是LIF分泌減少導(dǎo)致不孕,還是LIFR的減少導(dǎo)致與之結(jié)合的LIF減少,從而影響了LIF的生物效應(yīng),還有待我們進(jìn)一步的研究證實(shí)。但目前的研究表明LIFR作為L(zhǎng)IF的低親和性受體,作為信號(hào)因子與受精卵相呼應(yīng),進(jìn)而使LIF與之結(jié)合,協(xié)助著床。LIF需先以較低親和力與受體LIFR結(jié)合,然后與gp130相互作用形成親和力高的復(fù)合物,二聚體形成后gp130磷酸化,激活Janus酶,磷酸化下游的信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子stat蛋白,從而進(jìn)入核內(nèi)激活下游轉(zhuǎn)錄因子,產(chǎn)生一系列生物效應(yīng)。gp130的stat結(jié)合位點(diǎn)基因敲除小鼠發(fā)生著床失敗,證明gp130可激活stat[8],是調(diào)節(jié)著床的重要環(huán)節(jié)[9]。而研究表明,LIF不能與gp130直接結(jié)合,因此LIFR是LIF發(fā)揮其生物活性的重要樞紐。本研究的結(jié)果提示我們,作為與受精卵相呼應(yīng)的信號(hào)因子——LIF的低親和性受體LIFR的表達(dá)下降或缺失,可能是導(dǎo)致原因不明原發(fā)不孕癥婦女子宮內(nèi)膜分泌中期LIF的表達(dá)與正常對(duì)照組相比明顯下降甚至缺失的主要原因。換句話說(shuō):患者子宮內(nèi)膜分泌中期LIFR的表達(dá)下降或缺失可能是原因不明原發(fā)不孕癥的發(fā)病原因。

但是,究竟是什么原因?qū)е翷IFR的表達(dá)出現(xiàn)這種變化尚不可知,我們將在繼續(xù)的研究中從基因角度進(jìn)行分析,找到LIFR的表達(dá)下降的深層次原因。從而為原因不明原發(fā)不孕癥的診斷與治療提供幫助,也可為新型避孕措施的研制提供新的思路。

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Expresstion of leukaemia inhibitory factor's receptor in endometrial of the patients with unexplained infertility

ZHANG Song-ling1,LI Chun-hong,WEI Zhen-tong,et al.(Dept.of Obstetrics and Gynecology,The First Hospital,Jilin University,Changchun130021,China)

ObjectiveTo investigate the expression of endometrialleukaemia inhibitory factor's receptor(LIFR)in patientswith unexplained infertility.MethodsBy a quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR),we detected the expression of LIFR in endometrium during mid-luteal phase in 30 cases infertility group(unexplained infertility)and 20 cases control group.ResultsThe level of LIFRmRNA expressionon endometrium during mid-luteal phase in infertility groupwas,significantly lower than those in the control group.ConclusionThe decreased expression of LIFR might be one of the major causes of unexplained infertility.

Endomertium;LIFR;Ovumimplantation;Infertility

Q816

A

1007-4287(2010)06-0881-03

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃白求恩基金資助項(xiàng)目(合同編號(hào)200705155)

*通訊作者

張松靈(1975-),女,吉林省長(zhǎng)春市人,主治醫(yī)師,醫(yī)學(xué)博士,現(xiàn)主要從事助孕技術(shù)與腫瘤干細(xì)胞的研究工作。

2009-05-09)