王海燕 胡揚(yáng) 郝鑫 許春艷 李燕春 衣龍彥 聶晶

1北京體育大學(xué)科研中心（北京100084） 2北京體育大學(xué)研究生院3北京體育大學(xué)運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)學(xué)院生化教研室 4江西師范大學(xué)

睪酮具有同化作用，可增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成，增加肌肉重量，刺激紅細(xì)胞生成，加速血紅蛋白合成，促進(jìn)體內(nèi)抗體形成，增加免疫功能和抗感染能力。雄激素的作用由其靶細(xì)胞內(nèi)雄激素受體（androgen receptor，AR）介導(dǎo)，AR結(jié)合容量的高低決定著體內(nèi)有效雄激素水平的高低，是雄激素發(fā)揮同化作用的限制性因素［1］。人AR基因位于Xq11～12，含8個(gè)外顯子。AR蛋白內(nèi)的長(zhǎng)度多態(tài)性多聚谷氨酰胺（Gln）n，由AR基因外顯子N端配體非依賴性轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)內(nèi)的（CAG）n編碼，此區(qū)域是決定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的主要區(qū)域［2］。（CAG）n在正常人中重復(fù)范圍是8～31次，平均22次左右。大量研究顯示，CAG重復(fù)次數(shù)與轉(zhuǎn)錄共激活作用呈負(fù)相關(guān)，即CAG重復(fù)次數(shù)增加，雄激素受體功能下降［3-7］。這一點(diǎn)在臨床上對(duì)CAG重復(fù)次數(shù)與雄性功能增加疾病的研究中也得到證實(shí)。AR基因（CAG）n多態(tài)影響體內(nèi)雄激素水平，而雄激素水平與運(yùn)動(dòng)效果密切相關(guān)，因此該多態(tài)可能也會(huì)影響各種形式的運(yùn)動(dòng)效果。但目前該多態(tài)對(duì)運(yùn)動(dòng)能力影響的研究還很少，對(duì)低氧訓(xùn)練效果影響的研究更為少見。

因此，本研究探討AR外顯子1（CAG）n多態(tài)性與低氧訓(xùn)練效果的關(guān)聯(lián)性，尋找預(yù)測(cè)低氧訓(xùn)練敏感性的分子遺傳學(xué)標(biāo)記。

1 對(duì)象和方法

1.1 受試者

北京體育大學(xué)體育系和運(yùn)動(dòng)系在校男性大學(xué)生71名，其中國家級(jí)健將1名，一級(jí)運(yùn)動(dòng)員5名，二級(jí)運(yùn)動(dòng)員42名。全部來自東北三省、河北、天津、山東等中國北方平原地區(qū)。身體健康、無家族疾病史，無親緣關(guān)系，并且均知情同意。實(shí)驗(yàn)前6個(gè)月無高原訓(xùn)練或居住史，實(shí)驗(yàn)前1個(gè)月及實(shí)驗(yàn)期間未服用包括鐵劑在內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑。其中，65名受試者完成本研究所有測(cè)試。受試者基本情況（mean±SE）：平均年齡 19.78±0.21歲，身高 177.67±0.64cm，訓(xùn)練時(shí)間 4.23±0.27年。

1.2 低氧訓(xùn)練方案

受試者進(jìn)行為期30天的低氧訓(xùn)練。低氧環(huán)境為人工模擬的常壓低氧環(huán)境（北京體育大學(xué)科研中心低氧訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)室），訓(xùn)練方案為高住高練低訓(xùn)（HiHiLo）。高?。好客淼脱跛咧辽?10h（晚 21∶00～次日晨 7∶00），O2濃度為14.3%～14.8%（模擬海拔高度約2800～3000米）；高練：低氧訓(xùn)練 3次/周，O2濃度為14.8%～15.4%（模擬海拔高度約2500~2800米），以個(gè)體常氧下75%VO2max為基礎(chǔ)強(qiáng)度蹬功率自行車30min/次（60r/min），運(yùn)動(dòng)過程中微調(diào)功率自行車負(fù)荷使受試者SpO2維持在90%左右（87%～93%）；低訓(xùn)：常氧環(huán)境下進(jìn)行平均5次/周、90分鐘/次的專項(xiàng)訓(xùn)練，其他時(shí)間自行安排活動(dòng)。北京平原地區(qū)的海拔高度為20～60米。

1.3 體重和最大攝氧量測(cè)試

分別于低氧訓(xùn)練前后測(cè)試受試者的體重和常氧環(huán)境下的VO2max。使用功率自行車遞增負(fù)荷法測(cè)試VO2max。遞增方法：運(yùn)動(dòng)頻率60轉(zhuǎn)/分，起始負(fù)荷90W，每2min遞增30W，在RPE達(dá)到17后，每2min遞增15W，直至力竭。VO2max判定標(biāo)準(zhǔn)：心率超過180次/分，呼吸商大于1.1，氧耗量不再增加，受試者經(jīng)鼓勵(lì)不能維持運(yùn)動(dòng)。VO2max測(cè)試數(shù)據(jù)為絕對(duì)值（VO2max）和相對(duì)值（rVO2max）。儀器：功率自行車（Monark818，瑞典），氣體代謝分析儀（Cortex-Metalyzer II型心肺功能測(cè)試系統(tǒng)和氣體自動(dòng)檢測(cè)儀，德國），體重計(jì)（健民電子體重計(jì)，中國）。

1.4 （CAG）n多態(tài)的基因型分析

從受試者血液白細(xì)胞中提取DNA，-80℃保存。PCR擴(kuò)增：（1）使用primier5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物，并用HEX標(biāo)記上游引物 5’端。forward：5’-HEX CCA GAA TCT GTT CCA CAG CGT GC-3’；reverse：5’-CCT CAT CCA GGA CCA GGT AGC CT-3’。（CAG）22次重復(fù) PCR 產(chǎn)物片段長(zhǎng) 269bp。（2）PCR 反應(yīng)體系 （20μl）：DNA 模板100ng，0.2μl Taq 酶（5U/μl），0.4μl dNTP（10mM），2μl Mg2+（25mM），上下游引物各 1μl（0.05μg/μl），2μl 10×buffer，13μl滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。（3）PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性 5min；循環(huán)參數(shù)：變性 94℃ 30s，退火 60℃ 30s，延伸 72℃ 30s，共 30個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10min。經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色檢測(cè)PCR產(chǎn)物。（4）熒光標(biāo)記復(fù)合STR（Short Tandem Repeat）-genescan方法檢測(cè) CAG 多態(tài)重復(fù)次數(shù)：Genescan-500〔Rox〕作為內(nèi)標(biāo)（美國 ABI公司），使用ABI-377DNA分析儀（美國ABI公司）確定片段長(zhǎng)度；genescan3.1軟件分析擴(kuò)增產(chǎn)物。隨機(jī)選取10個(gè)PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序以校驗(yàn)以上分析的準(zhǔn)確性。（CAG）22次重復(fù)等位基因的片段長(zhǎng)度為266bp。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

根據(jù)AR基因CAG重復(fù)次數(shù)對(duì)受試者分組，分別以21和22次重復(fù)等位基因作為分割點(diǎn)。受試者分別被分為短鏈組（≤21次）和長(zhǎng)鏈組（>21次），以及短鏈組（≤22次）和長(zhǎng)鏈組（>22次）。體重和VO2max對(duì)低氧訓(xùn)練的應(yīng)答采用以下公式計(jì)算［Δ=（訓(xùn)練后－訓(xùn)練前）/訓(xùn)練前×100%］。

若方差齊性則采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析不同基因型組間各指標(biāo)差異，方差不齊則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)；各組受試者低氧訓(xùn)練前后的比較使用配對(duì)t檢驗(yàn)；低氧訓(xùn)練后不同基因型組間VO2max增加和降低的人數(shù)分布頻率差異采用卡方檢驗(yàn)；將 AR（CAG）n重復(fù)次數(shù)作為連續(xù)變量，采用直線相關(guān)分析其與VO2max的相關(guān)性。采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件處理所有數(shù)據(jù)，結(jié)果以Mean±SE表示。雙尾檢測(cè)，顯著性水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 （CAG）n多態(tài)分布特點(diǎn)

本研究受試者均為男性，AR基因位于X性染色體上，因此在男性中不需做Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。在男性中只有一個(gè)（CAG）n等位基因，因此等位基因也是基因型。

在受試者中觀察到（CAG）12，（CAG）16-28，（CAG）30共15種重復(fù)次數(shù)的等位基因和基因型。其中22次重復(fù)分布頻率最高，達(dá)到18%（圖1）。

2.2 （CAG）n多態(tài)與體重的關(guān)聯(lián)性

低氧訓(xùn)練后，所有65名受試者體重平均值從68.23±0.88kg降到67.70±0.87kg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.005）。當(dāng)分別以（CAG）21次和22次重復(fù)分組時(shí)，發(fā)現(xiàn)短鏈組低氧訓(xùn)練前體重基礎(chǔ)值顯著性低于長(zhǎng)鏈組（表1）。

2.3 （CAG）n多態(tài)與VO2max關(guān)聯(lián)性

低氧訓(xùn)練后，所有65名受試者VO2max絕對(duì)值平均值從 3.09±0.06 增加到 3.24±0.05（P=0.00），相對(duì)值平均值 rVO2max 從 45.13±0.72 增加到 47.98±0.80（P=0.00），均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分別以21次和22次重復(fù)等位基因作為分割點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈和短鏈基因型攜帶者組間低氧訓(xùn)練前最大攝氧量絕對(duì)值和相對(duì)值指標(biāo)均無顯著性差異，但低氧訓(xùn)練后短鏈組ΔVO2max和ΔrVO2max增加幅度均極顯著性高于長(zhǎng)鏈組，P<0.01（表1）。與低氧訓(xùn)練前基礎(chǔ)值相比，低氧訓(xùn)練后短鏈（≤21次和≤22次）組VO2max和rVO2max顯著增加，P均為0.00；而在>21次組VO2max和rVO2max增加的顯著性分別為P=0.09和P=0.02，在>22次組則無顯著性P=0.52和P=0.20。

表1 AR基因（CAG）n多態(tài)不同基因型攜帶者VO2max和體重

相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，（CAG）n重復(fù)次數(shù)與 ΔVO2max和ΔrVO2max呈顯著負(fù)相關(guān)（圖2），Pearson相關(guān)系數(shù)分別為-0.378和-0.384，P值均為0.002。不同基因型組中，對(duì)ΔVO2max（ΔrVO2max）增加和下降的人數(shù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)短鏈組ΔVO2max（ΔrVO2max）增加的人數(shù)顯著高于下降的人數(shù)（表2）。

表2 AR基因（CAG）n多態(tài)不同基因型組間ΔVO2max變化分布頻率

3 討論

3.1 中國北方漢族男性AR基因（CAG）n多態(tài)的分布特征

AR中N端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域?qū)ε潴w引發(fā)AR活性至關(guān)重要。該區(qū)域包含一個(gè)多谷氨酸鹽（Gln）n重復(fù)多態(tài)，由exon 1序列5’端的（CAG）n編碼。（CAG）n在正常人中重復(fù)范圍是 8～31次，平均 21±2次。AR基因（CAG）n多態(tài)在人群當(dāng)中的分布具有明顯的種族差異。本研究觀察到（CAG）12，（CAG）16-28，（CAG）30，共 15 種重復(fù)次數(shù)的等位基因和基因型，其中22次重復(fù)分布頻率最高，其次是23、24和25次重復(fù)。非洲人AR基因（CAG）n平均重復(fù)次數(shù)在18至20次之間，高加索人群的重復(fù)次數(shù)在21至22次之間，而東亞人的重復(fù)次數(shù)則在22至23次之間［8］。

3.2 AR基因（CAG）n多態(tài)與體重的關(guān)聯(lián)性

本研究發(fā)現(xiàn)，CAG短鏈組體重基礎(chǔ)值顯著低于常鏈組，低氧訓(xùn)練后兩組體重變化量仍存在顯著性差異，但體重變化率無顯著性差異。文獻(xiàn)對(duì)AR基因CAG多態(tài)重復(fù)長(zhǎng)度與體成分關(guān)系的報(bào)道并不完全一致。CAG重復(fù)長(zhǎng)度與36～81歲男子的Bmi相關(guān)［9］，并與男性瘦體重呈正相關(guān)［10］。然而，有研究發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)長(zhǎng)度與 20～50歲健康男性的Bmi或體脂百分比相關(guān)［11］。也有研究報(bào)道CAG重復(fù)長(zhǎng)度與老年男性體成分，包括體重、腰圍、腰/臀比和體脂百分比之間沒有直接相關(guān)，盡管較長(zhǎng)CAG重復(fù)者的睪酮水平更低［12，13］。

3.3 AR基因（CAG）n多態(tài)與VO2max關(guān)聯(lián)性

分別以重復(fù)21和22次等位基因作為分割點(diǎn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)除≤22次組VO2max低于>22次組外，長(zhǎng)鏈和短鏈基因型攜帶者組間低氧訓(xùn)練前VO2max和rVO2max指標(biāo)均無顯著性差異?！?2次組VO2max絕對(duì)值顯著低于>22次組，但相對(duì)值無顯著性差異。

低氧訓(xùn)練后，所有受試者VO2max和rVO2max均顯著增加（P<0.01），說明本研究采用的HiHiLo低氧訓(xùn)練方法能提高耐力運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)合AR（CAG）n多態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)低氧訓(xùn)練后短鏈組ΔVO2max和ΔrVO2max均極顯著高于長(zhǎng)鏈組。與低氧訓(xùn)練前基礎(chǔ)值相比，低氧訓(xùn)練后短鏈（≤21次和≤22次）組VO2max和rVO2max顯著增加，P均為0.00；而在>21組僅rVO2max顯著增加，在>22次組則無顯著性變化。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，（CAG）n重復(fù)次數(shù)與ΔVO2max和ΔrVO2max呈顯著負(fù)相關(guān)。低氧訓(xùn)練后，短鏈組ΔVO2max和ΔrVO2max增加的人數(shù)顯著性多于長(zhǎng)鏈max max該組受試者的5%。因此，AR基因（CAG）n多態(tài)與中國北方漢族男性常壓低氧環(huán)境下HiHiLo訓(xùn)練效果之間存在關(guān)聯(lián)性，較短基因型攜帶者低氧訓(xùn)練后耐力水平提高更明顯。

對(duì)AR基因（CAG）n多態(tài)與運(yùn)動(dòng)能力的報(bào)道較少。王海燕等［14］在中國北方漢族男性 AR（CAG）n多態(tài)與跑節(jié)省化的關(guān)聯(lián)性研究中發(fā)現(xiàn)，該多態(tài)與跑節(jié)省化的初始值存在關(guān)聯(lián)性，≤23次組的攝氧量初始值顯著高于>23次組，提示該多態(tài)與有氧運(yùn)動(dòng)能力可能存在一定的關(guān)聯(lián)性。但有研究在脊髓延髓肌萎縮癥（SBMA）病人中發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)病理性增加，其進(jìn)行12周中等強(qiáng)度有氧訓(xùn)練并未使VO2max增加［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，>22次長(zhǎng)鏈組受試者低氧訓(xùn)練后，VO2max的增加也未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但≤21次組VO2max和rVO2max均顯著增加。

雄激素在細(xì)胞內(nèi)與AR結(jié)合后形成雄激素受體復(fù)合物后進(jìn)入核內(nèi)，通過一系列受體后機(jī)制將細(xì)胞外的雄激素信號(hào)傳導(dǎo)到DNA上，調(diào)控特殊的基因表達(dá)，產(chǎn)生雄激素的生物效應(yīng)。AR結(jié)合容量的高低決定著體內(nèi)有效雄激素水平的高低，是雄激素發(fā)揮同化作用的限制因素［1］。AR中N端轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域?qū)ε潴w引發(fā)AR活性至關(guān)重要。臨床和離體研究均發(fā)現(xiàn)，AR轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性與該區(qū)域包含的CAG重復(fù)次數(shù)呈負(fù)相關(guān)，存在短重復(fù)序列基因型攜帶者雄激素水平高于長(zhǎng)重復(fù)序列的現(xiàn)象［3-7］。該多態(tài)與內(nèi)分泌失調(diào)有關(guān)，臨床上觀察到較低的CAG重復(fù)次數(shù)與增強(qiáng)的雄性功能有關(guān)，如前列腺癌、男性禿頭癥、多毛癥等；而在非病理的正常范圍內(nèi)（<35～37次重復(fù)），較高的重復(fù)次數(shù)與降低的雄性功能有關(guān)［16］。當(dāng)CAG多態(tài)編碼的多聚谷氨酰胺超過38次重復(fù)時(shí)將導(dǎo)致脊髓延髓肌萎縮癥（SBMA）［17］。

本研究中，分別使用生物軟件RNA Structure4.2和EMOSS3.0 in Linux對(duì)（CAG）n多態(tài)mRNA和蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)CAG重復(fù)將使AR mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中形成一個(gè)穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)（stem-loop structure），CAG重復(fù)次數(shù)多引起mRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度增加，使mRNA形成更為穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，影響其轉(zhuǎn)錄過程。由（CAG）n多態(tài)編碼的AR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的多聚谷氨酰胺（Gln）從9次重復(fù)開始增加兩個(gè)β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，在9次重復(fù)之后，每增加一個(gè)Gln就增加一個(gè)β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)。盡管增加的β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對(duì)AR蛋白的作用仍不清楚，但大多數(shù)β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)位于蛋白表面，是蛋白生物活性的重要空間結(jié)構(gòu)。

因此，AR基因（CAG）n多態(tài)性可能通過影響體內(nèi)雄激素水平和活性，進(jìn)而影響低氧訓(xùn)練效果。這可能是不同基因型組間低氧訓(xùn)練前后運(yùn)動(dòng)能力出現(xiàn)顯著性差異的主要原因之一。

4 總結(jié)

本研究以AR基因（CAG）n多態(tài)21次和22次重復(fù)等位基因作為分割點(diǎn)劃分基因型，分析中國北方漢族男性該重復(fù)多態(tài)與低氧訓(xùn)練后VO2max變化的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AR基因（CAG）n多態(tài)與常壓低氧環(huán)境下HiHi-Lo者的低氧訓(xùn)練敏感性較好。

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