楊 洋,李文蘭,季宇彬,代岐昌

(1.哈爾濱商業(yè)大學生命科學與環(huán)境科學研究中心,哈爾濱 150076;2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心,哈爾濱 150076)

八珍湯源自明代薛氏醫(yī)案《正體類要》,方由人參、茯苓、甘草 、白術(shù) 、當歸 、熟地、白芍、川芎 8味中藥組成,為補氣方四君子湯和補血方四物湯的合方,是中醫(yī)臨床“氣血雙補”的代表方劑,常用于治療氣血皆虛諸證[1].現(xiàn)代化學研究表明,阿魏酸和芍藥苷是八珍湯的主要活性成分,具有改善造血功能、改善血液流變性、提高機體免疫能力、抗氧化抗衰老、抗腫瘤等作用[2].

在口服藥物占主導地位的今天,藥物吸收的程度和速度就成為決定其藥用價值的首要環(huán)節(jié).鑒于八珍湯中芍藥苷、阿魏酸的藥理活性和藥用價值,本實驗采用在體循環(huán)灌流法對八珍湯中芍藥苷、阿魏酸的吸收動力學的各影響因素進行研究,揭示其吸收機制和規(guī)律,從而指導臨床用藥,為口服劑型設(shè)計提供科學的理論依據(jù).

1 儀器、藥品、試劑和動物

儀器:Waters HPLC(W2695泵 、W 2996DAD檢測器、自動進樣器、Empower化學工作站);HL-2型恒流泵(上海嘉鵬科技有限公司);水浴鍋(上海一恒儀器有限公司);751型紫外分析儀(上海光譜儀器有限公司);pH酸度計(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);電子天平(美國奧好斯科技有限公司).藥品與試劑:芍藥苷、阿魏酸對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:110736-200320、0773-9910);所有藥材人參 (Panax ginseng C.A.Mey.)、熟地黃 (Radix Rehmanniae praeparata)、白芍(Paeonia lactiflora Pall)、當歸(Angelica sinensis(Oliv.)Diels)、白 術(shù) (Atractylodes macrocephala Koidz.)、茯苓 (Poriacocos(Schw.)Wolf)、川芎 (Ligusticum chuanxiong Hort)、甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)均經(jīng)鑒定符合中國藥典 2005版規(guī)定的質(zhì)量標準要求;水合氯醛;酚紅;雙蒸水;KB緩沖液(NaCl 6.87 g/L、KCl 0.4 g/L、NaHCO32.2 g/L、NaH2PO40.13 g/L、MgSO40.122 g/L、CaCl20.25 g/L、葡萄糖 5 g/L);甲醇 (色譜純),醋酸 (分析純).動物:雄性 Wistar大鼠(225±20)g購自長春國家生物產(chǎn)業(yè)基地實驗動物中心,批號 SCXK-(吉)2008-0009.

2 方法與結(jié)果

2.1 試液的配制

空白循環(huán)液:精密稱酚紅 50.0 mg置于 250 mL量瓶中,以 KB緩沖液定容配成 0.2 mg/mL空白循環(huán)液.

八珍湯樣品溶液:取人參、熟地黃、白芍、當歸、白術(shù)、茯苓、川芎各 30 g,甘草 15 g,粉碎至 80目.以 10倍量的甲醇 75℃水浴回流提取 3次,每次 1 h,過濾,合并濾液,減壓回收至無醇味,回收液冷凍干燥得粉末即為當歸樣品.取不同量的當歸樣品,以空白循環(huán)液充分溶解,3 000 r/m in離心 15min,取上清液并定容于 100 mL容量瓶中,配制成含芍藥苷、阿魏酸不同質(zhì)量濃度的八珍湯樣品溶液.

混合標準品溶液:分別精密稱取芍藥苷 20.00 mg,阿魏酸 2.0mg用 KB緩沖液定容于 25mL容量瓶中,配制成含芍藥苷質(zhì)量濃度為 0.8mg/mL,阿魏酸質(zhì)量濃度為0.08mg/m L的混合標準品溶液.

2.2 循環(huán)液中酚紅質(zhì)量濃度的測定

2.2.1 酚紅檢測波長的選擇

分別取上述四種溶液適量,在 200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描.結(jié)果表明,酚紅在 558 nm波長處呈現(xiàn)最大吸收,而在此波長條件下,芍藥苷、阿魏酸、八珍湯樣品無吸收.因此,確定該波長為酚紅的檢測波長[3].

2.2.2 酚紅標準曲線繪制

精密稱酚紅 20.0 mg置于 100 mL量瓶中,以KB緩沖液定容配成 0.2mg/m L酚紅標準儲備液,分別移取 5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 m L于 100 mL量瓶中,以 KB緩沖液定容配成 0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL的酚紅標準溶液.各取上述酚紅標準溶液 0.5m L,加入 0.2mol/LNaOH溶液 5.0mL搖勻,用 UV法在 558 nm處測定吸光度,以吸光度對質(zhì)量濃度進行線性回歸,求得酚紅標準曲線方程:Y=15.187X+0.0193,r=0.9975(n=5).表明酚紅在 0.01～0.05 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.3 循環(huán)液中藥物質(zhì)量濃度測定

2.3.1 色譜條件的建立

色譜柱:Waters C18(4.6×250mm,5μm);流動相:甲醇 -0.1%醋酸水溶液(76:24);流速 1.0 mL/min;柱溫 37℃;檢測波長 237、320 nm.取混合標準品溶液、八珍湯樣品溶液和空白循環(huán)液適量,分別過 0.45μm微孔濾膜,進樣 10μL,見色譜圖1.

圖1 對照品、空白循環(huán)液和八珍湯樣品HPLC圖

由圖1可見:空白循環(huán)液對芍藥苷、阿魏酸吸收無干擾,其色譜峰峰形良好,保留時間分別為11.25 min和 18.26 min.因此,確定以該條件測定循環(huán)液中芍藥苷、阿魏酸的質(zhì)量濃度.

2.3.2 芍藥苷、阿魏酸標準曲線繪制

以適量的 KB緩沖液將混合標準品溶液(芍藥苷質(zhì)量濃度為 0.8mg/m L,阿魏酸質(zhì)量濃度為 0.08 mg/m L)分別稀釋成含芍藥苷 0.64、0.32、0.16、0.08、0.04 mg/mL,含阿魏酸 0.064、0.032、0.016、0.008、0.004mg/m L的溶液.將上述各質(zhì)量濃度溶液過 0.45μm微孔濾膜,分別進樣 10μL,以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸,求得芍藥苷標準曲線方程為:Y=10 984 482.083 6x-109 896.1605,r=0.999 7,(n=3);阿魏酸標準曲線方程為:Y=29 808 192.804 4x-20 924.206 6,r=0.999 9,(n=3)表明芍藥苷在 0.04～0.64mg/mL,阿魏酸在 0.004～0.064mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.4 方法學考察

2.4.1 芍藥苷、阿魏酸與酚紅溶液的穩(wěn)定性試驗

分別取混合標準品溶液和空白循環(huán)液適量,置(37±0.5)℃恒溫水浴中保溫 2.5 h,于 0.5、1、1.5、2、2.5 h分別取樣,并對混合標準品溶液中芍藥苷、阿魏酸進行 HPLC測定,對空白循環(huán)液中的酚紅進行紫外分光光度測定,代入各自的標準曲線方程計算質(zhì)量濃度.測得芍藥苷、阿魏酸及酚紅的RSD分別為 0.77%、1.29%和 1.20%,結(jié)果表明在

2.5 h內(nèi)各溶液穩(wěn)定性良好.

2.4.2 回收率與精密度試驗

分別制成高、中、低 3個質(zhì)量濃度的芍藥苷、阿魏酸與酚紅供試品溶液,于 1 d內(nèi)重復測定 5次,計算日內(nèi)精密度 RSD分別為 0.74%、0.38%、0.80%(n=3);每日測定 1次,連續(xù)測定 3 d,計算日間精密度 RSD分別為 0.78%、0.48%、0.49%(n=3).在上述溶液中加入不同量芍藥苷、阿魏酸與酚紅對照品,使其達到樣品中各物質(zhì)含量的120%、100%、80%,計算平均回收率分別為98.7%、98.4%、97.7%(n=3).

2.5 大鼠在體腸吸收實驗方法

將大鼠禁食過夜(自由飲水),用 10%水合氯醛腹腔注射麻醉,劑量為(0.3 mL/100g)[4-5],固定,置加熱器上隨時調(diào)溫以保持體溫.沿腹腔中線打開腹腔,結(jié)扎膽總管,并分離出所需胃腸段,于切口處插管(出液口插管約 3 cm),結(jié)扎.首先用適量的生理鹽水將胃、小腸內(nèi)容物沖洗干凈,然后用預熱的 37℃的 KB緩沖液以 5m L/min的速度恒定流速平衡 10 min,排凈空氣,將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕,于紅外燈下保持大鼠體溫.八珍湯樣品溶液 50 mL保持(37±0.5)℃恒溫,以5mL/m in循環(huán) 10min后,記為 0時,后八珍湯樣品液以 1 m L/min的流速循環(huán) 180 min.分別于 20、40、60、80、100、120 min時于供試品小瓶中取 2 mL供試液樣品,用微孔濾膜過濾后,取濾液 1 mL進樣,測定各時間點芍藥苷、阿魏酸的量;另外取 0.5 mL濾液測定酚紅的量.同時補加 2 m L酚紅溶液.最后將大鼠處死,取剪下被灌流腸段,測量腸內(nèi)徑及長度[6-7].采用上述實驗方法分別考察樣品液中芍藥苷、阿魏酸質(zhì)量濃度、pH值、腸段及 P-gp各因素對其在腸道吸收的影響規(guī)律.

數(shù)據(jù)處理:1)由剩余藥量可求得藥物吸收量;2)以剩余藥量的對數(shù)值對取樣時間作線性回歸,由斜率求得吸收速率常數(shù) Ka(h-1);3)由 Ka可求得 t1/2(h)=0.693/Ka;(4)由 2h剩余藥量的變化值對零時間剩余藥量比可求出藥物的累積吸收百分率A(%).

2.5.1 腸壁物理吸附的排除

剪取清洗后的大鼠腸段約 10 cm,用玻璃棒將黏膜層翻出,置 50 mL的人參樣品液中,于(37±0.5)℃孵育 3 h,取出腸段,測定孵育液中的芍藥苷、阿魏酸質(zhì)量濃度,其質(zhì)量濃度分別為原藥物質(zhì)量濃度的(98.67±0.45)%(n=5)、(98.14±0.76)%(n=5),可認為大鼠腸壁對藥物基本無物理吸附[8].

2.5.2 小腸灌流液對芍藥苷、阿魏酸化學降解的排除

將大鼠做全腸道插管,用空白循環(huán)液 50m L循環(huán)灌流 2 h后,用灌流液配制 3份質(zhì)量濃度相同的八珍湯樣品液,置(37±0.5)℃孵育 3 h,測定孵育前后藥物質(zhì)量濃度,分別計算孵育后剩余百分比為(99.04±0.94)%(n=5),(98.53±0.65)%(n=5),表明芍藥苷、阿魏酸在循環(huán)液液中無化學降解.

2.5.3 質(zhì)量濃度對芍藥苷、阿魏酸吸收的影響

由于腸道平均 pH值為 7.4,故選擇循環(huán)液 pH值為 7.4的生理條件下,采用整腸段循環(huán)灌流法考察不同質(zhì)量濃度八珍湯樣品液(含芍藥苷的質(zhì)量濃度分別為 0.08、0.16、0.32、0.64 mg/m L;阿魏酸的質(zhì)量濃度分別為 0.008、0.016、0.032、0.064 mg/mL)的吸收情況.數(shù)據(jù)見表1.經(jīng)線性回歸統(tǒng)計,芍藥苷、阿魏酸的吸收量對質(zhì)量濃度的回歸方程分別為:Y=0.113 1X+2.442 7,r=0.998 6;Y=0.649 8X+0.241 4,r=0.993 8,表明芍藥苷 、阿魏酸分別在 0.08～0.64 mg/mL和 0.008～0.064 mg/mL范圍內(nèi),各質(zhì)量濃度的吸收量與藥物質(zhì)量濃度呈良好線性關(guān)系.經(jīng)方差分析,吸收速率常數(shù)(Ka)、累積吸收百分率 A和 t1/2基本保持不變(P＞0.05),符合一級動力學過程.提示芍藥苷、阿魏酸的吸收過程均為被動擴散過程.

表1 不同質(zhì)量濃度芍藥苷、阿魏酸吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

表1 不同質(zhì)量濃度芍藥苷、阿魏酸吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

質(zhì)量濃度/(mg·m L-1) Ka/h-1 吸收量/(mg·h-1) t1/2/h A/%0.08 0.142 8±0.021 4 2.451 5±0.028 9 4.938 1±0.715 2 36.33±10.23芍藥苷0.16 0.159 6±0.012 4 2.462 5±0.033 7 4.363 6±0.345 2 28.27±4.82 0.32 0.174 0±0.014 7 2.477 1±0.354 9 4.005 5±0.337 1 36.97±8.02 0.64 0.164 4±0.040 4 2.515 7±0.332 9 4.428 2±1.110 9 26.25±3.49 0.008 0.363 0±0.230 1 0.248 0±0.028 2 2.522 6±1.235 6 38.69±13.01阿魏酸0.016 0.381 6±0.106 0 0.250 9±0.074 0 1.909 2±0.427 4 38.06±16.52 0.032 0.412 8±0.073 3 0.260 9±0.002 7 1.722 9±0.302 7 40.46±1.54 0.064 0.424 8±0.027 3 0.283 5±0.018 1 1.636 7±0.103 1 45.81±3.35

2.5.4 pH值對芍藥苷、阿魏酸吸收的影響

腸道平均 pH值為 7.4,考慮到藥物吸收可能受到循環(huán)液 pH值的影響,故取含芍藥苷、阿魏酸濃度分別為 0.16、0.016mg/mL的八珍湯樣品液,采用整腸段循環(huán)灌流法,考察循環(huán)液在 pH值為6.4、7.4、8.4條件時,芍藥苷、阿魏酸的吸收情況 ,探討 pH值對其吸收的影響.數(shù)據(jù)見表2.

表2 不同pH值條件下芍藥苷、阿魏酸吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

表2 不同pH值條件下芍藥苷、阿魏酸吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

注:(阿魏酸)與pH值為 7.4比*P＜0.05顯著性差異,**P＜0.01極顯著性差異

pH值 Ka/h-1 吸收量/(mg·h-1) t1/2/h A/%6.4 0.187 2±0.025 9 2.288 6±0.490 5 3.762 8±0.549 7 27.31±2.28芍藥苷 7.4 0.159 6±0.012 4 2.462 5±0.033 7 4.363 6±0.345 2 28.27±4.82 8.4 0.182 4±0.043 6 2.703 0±0.600 9 3.995 7±1.040 0 28.39±4.22 6.4 0.532 8±0.115 1* 0.331 3±0.013 5** 1.342 7±0.245 8 58.82±6.09**阿魏酸 7.4 0.381 6±0.106 0 0.250 9±0.074 0 1.909 2±0.427 4 38.06±16.52 8.4 0.222 0±0.042 6** 0.213 4±0.023 1 3.220 8±0.647 8* 36.24±0.67

經(jīng)方差分析表明,循環(huán)液的 pH值對芍藥苷的小腸吸收在吸收量、吸收速率、累積吸收百分率及t1/2方面均無顯著變化(P＞0.05);阿魏酸在不同pH值條件下,隨著 pH值的增大,吸收量、吸收速率及累計吸收百分率減小,t1/2顯著增大(P＜0.5),表明阿魏酸在酸性條件下易于被吸收.

2.5.5 不同腸段對芍藥苷、阿魏酸吸收的影響

取含芍藥苷、阿魏酸濃度分別為 0.16、0.016 mg/mL的八珍湯樣品液,在循環(huán)液 pH值為 7.4條件下,分別考察芍藥苷、阿魏酸在小腸不同吸收部位十二指腸、空腸及回腸的吸收情況,以明確芍藥苷、阿魏酸吸收的部位選擇性.數(shù)據(jù)見表3.

表3 不同腸段芍藥苷、阿魏酸的吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

表3 不同腸段芍藥苷、阿魏酸的吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

注:*P＜0.05顯著性差異,**P＜0.01極顯著性差異

腸段 Ka/h-1 吸收量/(mg·h-1) t1/2/h A/%胃0.174 0±0.070 4 0.011 5±0.032 7 4.701 2±2.435 1 30.45±6.28芍藥苷十二指腸 0.190 8±0.015 5 1.080 0±0.171 2 3.652 0±0.307 4 27.93±5.86空腸 0.164 4±0.010 9 1.047 5±0.286 3 4.230 6±0.287 4 26.22±5.93回腸 0.165 6±0.038 8 1.051 9±0.048 0 4.367 8±0.981 8 26.35±1.46結(jié)腸 0.163 2±0.020 1 0.872 0±0.100 6 4.299 1±0.537 6 23.30±2.70胃0.220 1±0.053 5* 0.153 3±0.026 5* 2.453 0±0.509 5* 37.62±2.83*阿魏酸十二指腸 0.192 0±0.035 0 0.085 3±0.011 9 3.711 3±0.703 0 26.38±2.83空腸 0.220 8±0.024 9 0.117 7±0.019 7 3.171 8±0.370 1 30.07±3.70回腸 0.213 6±0.032 8 0.103 6±0.040 2 3.315 0±0.579 6 27.78±10.75結(jié)腸 0.183 6±0.022 7 0.074 9±0.010 0 3.818 8±0.448 8 24.10±3.24

經(jīng)方差分析表明:八珍湯樣品液在腸道循環(huán)灌流 120m in后,各個腸段循環(huán)液中芍藥苷的吸收量、Ka、t1/2及 A值均無顯著性差異 (P＞0.05),表明芍藥苷在全腸段均有吸收.但胃循環(huán)液中阿魏酸的吸收量、Ka、t1/2及 A值均有顯著性差異(P＜0.05),表明阿魏酸在胃中更易被吸收.

2.5.6 P-gp對芍藥苷、阿魏酸吸收的影響

取含芍藥苷、阿魏酸質(zhì)量濃度分別為 0.16、0.016 mg/m L的八珍湯樣品液,在循環(huán)液 pH值為7.4條件下,考察利福平促進、維拉帕米[9-10]抑制 P-gp條件下的芍藥苷、阿魏酸吸收情況,驗證二者的吸收是否受到 P-gp外泵作用影響.數(shù)據(jù)見表4.

表4 P-gp抑制劑對芍藥苷、阿魏酸的吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

表4 P-gp抑制劑對芍藥苷、阿魏酸的吸收量、吸收速率常數(shù)、t1/2及累積吸收百分率(n=5 ˉ±S)

注:與對照組相比,*P＜0.05顯著性差異,**P＜0.01極顯著性差異

P-gp的作用 Ka/h-1 吸收量/(mg·h-1) t1/2/h A/%含利福平組 0.108 0±0.036 2* 1.726 3±0.789 1* 5.667 4±1.427 7* 16.42±9.12*芍藥苷 對照組 0.159 6±0.012 4 2.462 5±0.033 7 4.363 6±0.345 2 28.27±4.82含維拉帕米組 0.199 2±0.029 8* 3.157 3±0.208 7* 3.282 7±0.283 4 38.31±5.35*含利福平組 0.262 8±0.040 6* 0.136 7±0.053 8* 2.352 2±0.209 8* 21.50±7.40*阿魏酸 對照組 0.381 6±0.106 0 0.250 9±0.074 0 1.909 2±0.427 4 38.06±16.52含維拉帕米組 0.483 6±0.052 6* 0.365 7±0.102 4* 1.365 4±0.167 2* 49.26±7.70

經(jīng)方差分析表明:含利福平組的吸收速率均較對照組有所降低(P＜0.05),而含維拉帕米組的吸收速率則較對照組有所升高(P＜0.05).說明芍藥苷、阿魏酸的吸收受 P-gp的外排作用影響,單獨使用生物利用度較低.

3 結(jié)論與討論

1)在實驗過程中,由于腸道對水分有吸收,故采用酚紅進行體積標定.但是有文獻報道,酚紅也能少量被小腸吸收,平均吸收速率為 6%.Ca2+離子能抑制酚紅的吸收[11-12].故本實驗采用含有一定濃度Ca2+的KB緩沖液配制循環(huán)液,以減小實驗誤差.

2)實驗結(jié)果表明八珍湯中的芍藥苷、阿魏酸吸收過程均為被動擴散過程.芍藥苷在大鼠消化道內(nèi)無特定吸收部位,且阿魏酸在酸性條件下易被吸收,提示可制備成胃吸收制劑或通過改變胃腸道的pH值促進八珍湯藥物更好的發(fā)揮藥效.

3)很多藥物的吸收會受到一種存在于腸上皮細胞頂端的藥物轉(zhuǎn)運蛋白 P-gp外排作用影響而具有較低的生物利用度,實驗表明芍藥苷、阿魏酸為 P-gp底物,受到 P-gp外泵作用,表明在臨床用藥應聯(lián)合應用 P-gp抑制劑以提高芍藥苷、阿魏酸的生物利用度,而避免 P-gp誘導劑降低芍藥苷、阿魏酸的生物利用度.

[1] 潘毓寧,潘洪平,石延書.八珍湯的化學成分、藥理作用及臨床應用研究進展[J].廣西醫(yī)學,1996,18(2):134-137.

[2] 張 超,南莉莉,孫 志,等.八珍湯物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理學研究進展[J].上海醫(yī)藥,2008,29(6):273-276.

[3] DU X H,NIU X.Study on absorption mechanism of genistein self-microemulsifying system in rat intestines[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2008,33(12):1406-1409.

[4] 杜 秋,狄留慶.在體單向腸灌流模型研究瑞像素的大樹腸吸收特性[J].藥學學報,2009,44(8):992-926.

[5] 趙艷紅,賈曉斌.淫羊藿黃酮類化合物的大鼠在體腸吸收研究[J].中國藥學雜志,2008,43(3):188-191

[6] YU LX,LIPKA E,CRISON JR,et al.Transport approaches to the biopharmaceutical design of oral drug delivery systems:prediction of intestinal absorption[J].Adv Drug Deliv Rev,2006,19(3):359-376.

[7] ZHOU P,LI L P.Intestinal absorption of luteolin from peanut hull extract ismore efficient than that from individual pure luteolin[J].JAgric Food Chem.2008,56(1):296-300.

[8] 徐叔云,卞如濂,陳 修,等.藥理實驗方法學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2003:70.

[9] TOMITA M,TAKIZAWA Y,KISHIMOTOH,etal.Effectof intestinal ischaem ia/reperfusion on P-glycoprotein-mediated ileal excretion of rhodamine 123 in the rat[J].JPharm Pharmacol.,2009;61(10):1319-24.

[10] VARMA M V,PANVHAGNULA R.Prediction of in vivo intestinal absorption enhancement on P-glycoprotein inhibition,from rat in situ permeability[J].JPharm Sci,2005,94(8):1694-704.

[11] 李文蘭,南莉莉,季宇彬,等.人參中人參皂苷 Rg1、Rb1在體腸吸收影響因素的研究[J].中國中藥雜志,2009,34(20):2627-2632.

[12] 張 超,李文蘭,南莉莉,等.均勻設(shè)計法優(yōu)選八珍湯總苷類部位的提取工藝[J].哈爾濱商業(yè)大學學報:自然科學版,2009,25(2):135-139,143.