樸勝華,楊霓之

(1.廣東藥學(xué)院中醫(yī)藥研究院,廣州 510006;2.廣東省中醫(yī)院,廣州 512120)

腎間質(zhì)纖維化(TIF)幾乎是所有慢性腎臟疾病進(jìn)展到后期的最終結(jié)果[1].無論腎臟病原發(fā)病因和部位在腎小球、腎小管還是腎血管,大多數(shù)進(jìn)展性腎病均可見到腎小管間質(zhì)纖維化.大量研究表明,TIF的程度與腎功能的相關(guān)性比腎小球硬化與腎功能的相關(guān)性更為密切 .因此,對其發(fā)病機制及防治的研究越來越受到國內(nèi)外研究者的重視.

通脈口服液由中醫(yī)腎臟病專家楊霓之教授研制,具有益氣活血作用,作為院內(nèi)制劑最初用于治療慢性腎炎取得了很好的臨床療效.前期課題組進(jìn)行了大量的臨床與實驗研究,證明其在一定程度上可延緩單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)致腎小管間質(zhì)纖維化,保護(hù)腎功能.本研究擬從調(diào)節(jié)纖維化細(xì)胞因子的角度,探討其作用機理,為確立益氣活血法防治腎間質(zhì)纖維化提供更充分的科學(xué)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 藥物

受試藥物:通脈口服液,由黃芪、三七等組成,由廣東省中醫(yī)院制劑中心提供.陽性對照藥:苯那普利,商品名洛汀新,北京諾華制藥有限公司生產(chǎn),批號:國藥準(zhǔn)字 X0267,規(guī)格為 10 mg/片.

1.2 實驗動物

Wistar大鼠,雄性,體重 230～250 g,由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物中心提供,合格證號:SCXK(粵)2003-0001.

1.3 模型制備

1.3.1 氣虛血瘀證模型制備

衰老模型:實驗第 4天至第 35天(d4～d35)各組大鼠每日皮下注射 D-半乳糖,劑量 48 mg/kg,以造成大鼠的亞急性衰老模型[2];疲勞模型:d4～d35實驗大鼠每日 14:00開始分批置入直徑 50 cm,高 100 cm水桶內(nèi),桶內(nèi)水深約 45 cm,水溫與室溫均保持為(10±0.5)℃ .以木棒拔打強迫其不斷游泳直到疲勞,時間長短存在個體差異,平均為(10±5)min.

1.3.2 UUO動物模型的制備

質(zhì)量分?jǐn)?shù) 5%的水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉后局部剃毛,常規(guī)消毒鋪孔巾,選擇腹正中線切口稍偏左,依次切開皮膚至腹腔,游離腎臟及輸尿管,將左側(cè)輸尿管用組織鉗托起中段部位,止血鉗夾住,在兩端用 4.0絲線結(jié)扎左側(cè)輸尿管近腎盂段及遠(yuǎn)端,在兩個結(jié)扎點之間剪斷輸尿管,然后用 4.0絲線連續(xù)縫合肌肉、皮膚.假手術(shù)組即空白對照組(K)大鼠手術(shù)入路方式同 UUO組,進(jìn)腹腔后分離左輸尿管但不結(jié)扎輸尿管[3].

1.4 實驗分組及給藥

將上述方法制備成的氣虛血瘀 UUO大鼠隨機分為假手術(shù)組即空白對照組(K)、模型組(M)、中藥高劑量組(TMH)、中藥中劑量組(TMM)、中藥低劑量組(TML)、西藥對照組(LTX).K、M組大鼠 37～58 d生理鹽水灌胃;TMH組大鼠 37 d～58 d TM(12mL/kg·d-1)灌胃;TMM組大鼠 37 d～58 dTM(8m L/kg·d-1)灌胃;TML組大鼠 37 d～58 dTM(4 mL/kg·d-1)灌胃;LTX組大鼠 37 d～58 d洛汀新(10 mg/kg·d-1)灌胃.

1.5 標(biāo)本收集與取材

d58各組大鼠腹主動脈取血制備血清,-70℃冰箱保存.梗阻側(cè)經(jīng)腎門正切的腎組織用 10%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛溶液固定,常規(guī)方法制備切片待檢.其余腎組織勻漿,離心后取上清.

1.6 觀測指標(biāo)與方法

1)大鼠腎組織 colIV、MMP-9、TIMP-1的表達(dá):免疫組織化學(xué)法.

2)大鼠腎組織 CTGFmRNA的表達(dá):原位分子雜交.

3)大鼠腎組織血清 t-PA、PAI含量的測定:Elisa法.

1.7 試劑及儀器

colIV、MMP-9、TIMP-1免疫組化試劑盒,CTGFmRNA原位雜交試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供;t-PA、PAIElisa檢測試劑盒由美國 USCN Life Science and Technology Company生產(chǎn),廣州威佳科技公司提供.Leiz型輪轉(zhuǎn)切片機(德國),LKB-V超薄切片機(奧地利),5320型自動閃爍 r計數(shù)儀(美國 PACKRD公司),電光源顯微鏡(日本 OLYMPUS),熒光顯微鏡(上海第二光學(xué)儀器廠).

1.8 統(tǒng)計方法

免疫組化和原為雜交結(jié)果用 GMIAS系列多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析,在顯微鏡(×200)分別取l5個不重復(fù)的腎小管間質(zhì)視野,結(jié)果以陽性目標(biāo)總面積/統(tǒng)計場總面積(面密度)來表示.

所有結(jié)果采用 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理,計量資料采用方差分析和 q檢驗,結(jié)果用±S表示.

2 實驗結(jié)果

2.1 對實驗性 UUO大鼠腎間質(zhì)colIV表達(dá)的影響

見表1.

表1 治療后各組大鼠腎間質(zhì)colIV表達(dá)的影響

2.2 對實驗性 UUO大鼠腎間質(zhì) MMP-9、TIMP-1表達(dá)的影響

見表2.

表2 治療后各組大鼠腎間質(zhì) MMP-9、TIMP-1的表達(dá)

2.3 對實驗性 UUO大鼠腎間質(zhì) CTGFmRNA表達(dá)的影響

見表3.

表3 治療后各組大鼠腎間質(zhì) CTGFmRNA的表達(dá)

2.4 對實驗性 UUO大鼠腎組織 t-PA、PAI含量的影響

見表4.

表4 治療后各組大鼠腎組織 t-PA、PA I含量

2.5 對實驗性 UUO大鼠血清 t-PA、PAI含量的影響

見表5.

表5 治療后各組大鼠血清 t-PA、PAI含量

3 討 論

TIF是一個復(fù)雜的病理過程,是多種原因共同作用的結(jié)果,以腎間質(zhì)中細(xì)胞及膠原成分聚集增多,伴有腎小管萎縮或擴(kuò)張變形,小管周圍毛細(xì)血管減少、荒廢,完整腎單位的進(jìn)行性減少及腎小球濾過率的持續(xù)性下降為特征.這一病變過程涉及細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)、細(xì)胞因子、生長因子及它們之間的相互作用[4].

TGF-β是參與腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)鍵的細(xì)胞因子[5-7],但 TGF-β抑制細(xì)胞增殖,抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等正面效應(yīng)的存在限制了其抗體的應(yīng)用.CTGF是由 TGF-β誘導(dǎo)產(chǎn)生的一種新的致纖維化蛋白,是 TGF-β的下游介質(zhì),可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的生長及成纖維細(xì)胞和系膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的分泌,在腎臟纖維化中也具有重要作用,是 TGF-β致前纖維化的標(biāo)志[8].因此,CTGF作為TGF-β促纖維活性的下游信號介質(zhì),作用相對單一,它可能僅介導(dǎo) TGF-β的部分生物學(xué)效應(yīng),即促進(jìn)組織器官纖維化方面起重要作用.探討其成為更加特異性藥物靶位點的可能性更大,為以后具有組織特異性手段的基因治療提供理論基礎(chǔ),成為防治腎臟纖維化領(lǐng)域新的熱點.

本研究表明具有益氣活血作用的中藥復(fù)方制劑“通脈口服液”能明顯下調(diào) CTGFmRNA的表達(dá),從基因水平抑制了 CTGF的表達(dá),從而抑制了 CTGF介導(dǎo)的致纖維化生物學(xué)效應(yīng),起到防治腎小管間質(zhì)纖維化的作用.

許多研究表明,TIF是由于基質(zhì)蛋白合成增加和基質(zhì)降解受抑制的綜合結(jié)果.調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解的主要為基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs/TIMPs)和凝血纖溶系統(tǒng)(PA/PAI).其中 MMP-9又稱明膠酶 B,主要降解明膠、Ⅳ、V、Ⅶ型膠原及層黏連蛋白、蛋白聚糖及彈性蛋白等,能降解完整的基底膜[9].MMP-9的抑制劑主要是 TIMP-1,文獻(xiàn)顯示 TIMP-1在多種表現(xiàn)為 ECM沉積的腎臟疾病中發(fā)揮作用[10-12].PA/PAI也是介導(dǎo)纖溶與抗纖溶平衡并參與調(diào)節(jié) ECM的重要酶系,它不僅直接參與 ECM多種成分如 LN、FN的降解,而且是其他ECM降解系統(tǒng)的上游系統(tǒng)[13],還是 MMP激活劑之一,被激活的 MMP可以降解 ECM的膠原成分[14].

在許多腎臟疾病進(jìn)展過程中,凝血纖溶系統(tǒng)異常會導(dǎo)致腎組織 ECM異常沉積和血栓微血管病變,引起腎小球硬化及腎小管間質(zhì)纖維化.各種臨床和實驗研究已證實 PA/PAI-1在 TIF的發(fā)生中起著重要的作用,t-PA、u-PA水平的升高和活性增強對腎臟起著保護(hù)作用,而 PAI-1則相反[15-17].PA/PAI-1在 TIF病變中的顯著變化,為其在 TIF發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了重要依據(jù).可以預(yù)見,維持 PA/PAI-l之間的平衡、預(yù)防和治療纖溶酶系統(tǒng)失調(diào)將為防止腎功能不全[18]、保護(hù)腎臟起到重要作用,也為臨床防治 TIF尋找到了一個新的突破點.現(xiàn)已通過大量臨床和實驗研究發(fā)現(xiàn),一些西藥和中藥及其有效成分的提取物可通過對 PA/AI-1的平衡起作用,來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)降解.

本研究結(jié)果表明,“通脈口服液”可下調(diào)腎小管間質(zhì) colIV的表達(dá),并可上調(diào) MMP-9的表達(dá),下調(diào)TIMP-1的表達(dá),提高 MMP-9/TIMP-1的比值,并能提高梗阻側(cè)腎組織的 t-PA的含量,降低 PAI的含量,提高 t-PA/PAI的比值,同時能下調(diào) CTGFmRNA的表達(dá),進(jìn)而通過細(xì)胞外基質(zhì)降解系統(tǒng)(MMPs/TIMPs、PA/PAI)、CTGF的復(fù)雜調(diào)節(jié)取得抗腎小管間質(zhì)纖維化的作用.

通脈口服液由黃芪、三七等成分組成,具有益氣活血作用,為扶正驅(qū)邪的方劑.根據(jù)中醫(yī)氣血理論,“氣能行血”,益氣可促進(jìn)活血.腎小管間質(zhì)纖維化病變多存在凝血、纖溶系統(tǒng)的異常,存在腎內(nèi)微循環(huán)的障礙,益氣活血藥可改善這一狀態(tài).且通過對“通脈口服液”的系列研究可以看出,通脈口服液可降低蛋白尿、改善患者的免疫功能、降低血脂、改善血液流變學(xué)指標(biāo),加上本次研究的結(jié)果,均證明了“通脈口服液”可以從不同的途徑改善腎小管間質(zhì)纖維化,進(jìn)而延緩腎硬化,改善、穩(wěn)定腎功能,同時也證明了中藥復(fù)方多中心、多靶點的作用機理.

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