郭顯超,王 磊,謝 華

(1.深圳市司法鑒定專家委員會,廣東深圳 518034;2.鄭州市公安局刑偵支隊河南鄭州 450004)

微量生物DNA:能發(fā)揮重要作用的生物物證

郭顯超1,王 磊2,謝 華2

(1.深圳市司法鑒定專家委員會,廣東深圳 518034;2.鄭州市公安局刑偵支隊河南鄭州 450004)

DNA技術(shù)在刑事案件偵破中發(fā)揮的作用愈顯重要,一些常見的生物檢材已經(jīng)有了正確發(fā)現(xiàn)和提取的意識和方法。但是,微量生物檢材還未引起現(xiàn)場勘查人員的普遍重視。如能對微量檢材盡可能地成功提取和檢驗,DNA檢驗就能夠在案件勘查中發(fā)揮更廣泛的作用。

微量 DNA;PCR;LCN;生物物證

隨著 DNA技術(shù)的普及,現(xiàn)場勘查人員對血斑、煙蒂、人體組織、毛發(fā)、精斑等常見檢材已有了正確發(fā)現(xiàn)和提取的意識和方法。然而,微量生物檢材還未引起現(xiàn)場勘查人員的普遍重視。微量 DNA,也稱低拷貝模板 (low copy number,LCN)DNA,顧名思義是指量少的 DNA,常常低于 50pg,常規(guī)方法難以檢測到理想的 DNA圖譜,是法醫(yī) DNA檢驗的難點之一。微量生物檢材涉及的檢材面很廣,理論上凡是與人體接觸的部位都會留下人體細胞,如唾液斑:煙蒂、水杯、飲料瓶 (罐 )、牙刷、牙簽、筷子、果核、口罩;存在脫落細胞的皮膚接觸部位:襯衣、內(nèi)褲、領(lǐng)帶、帽子、手套、襪子、鑰匙、挖耳勺、刀柄,汽車方向盤;人體排泄物:汗液、尿液。如能對上述微量檢材盡可能地成功提取和檢驗,DNA檢驗就能夠在案件勘查中發(fā)揮更廣泛的作用。

1990年以后,PCR技術(shù)的出現(xiàn),大大提高了法醫(yī)DNA分析技術(shù)的靈敏度。特別是短串聯(lián)重復(fù)序列 STR(short tandem repea)的發(fā)現(xiàn),由于其具有易于擴增,對 DNA的質(zhì)量要求低,故 PCR擴增成功率高,檢測靈敏度高,重復(fù)性好,適用于微量、陳舊甚至腐敗檢材的 DNA分型鑒定。STR基因座分型方法簡便、判型準(zhǔn)確,分型程序明確、規(guī)范,所得分型結(jié)果圖形簡單,有利于實現(xiàn) DNA分型標(biāo)準(zhǔn)化和自動化,有利于DNA分型數(shù)據(jù)的計算機存儲、聯(lián)網(wǎng)檢索。因此 STR復(fù)合擴增技術(shù)已成為法醫(yī) DNA實驗室對微量生物物證進行檢驗的主要手段。

利用 STR復(fù)合擴增技術(shù),鄭州市公安局的 DNA實驗室每年都檢驗逾千起案件,直接破獲和串并案件多起。處理低拷貝模板 DNA,應(yīng)從以下四個方面做起:

一、微量生物物證的提取、保存和送檢

現(xiàn)場生物物證的發(fā)現(xiàn)和提取是 DNA檢驗成功的重要步驟。只有得到足量的模板 DNA,才有可能發(fā)揮排除或認定的功效,而微量生物物證的成功提取是足量模板DNA提取的保障。

生物物證提取要注意兩點:

1.防止污染:提取人員應(yīng)注意戴口罩、鞋套、手套、頭套,切忌直接觸摸檢材。

2.提取充分完全,盡可能多地收集目標(biāo)細胞。提取時,對于小件物體,原物提取送檢。若載體條件不允許,可用兩步轉(zhuǎn)移法[3],取 2-5根長約 0.5㎝的紗線或 0.3×0.3㎝的脫脂棉,用雙蒸水浸濕后反復(fù)擦拭提取部位,再用同樣大小的紗線或棉球反復(fù)擦干,均放入試管內(nèi)送檢。對于吸水性載體,需采取刮擦的方法提取?，F(xiàn)場提取的方法還有:公安部物證鑒定中心研發(fā)的生物脫落細胞提取儀提取法,膠帶粘附法。

二、微量 DNA的提取

DNA提取的常規(guī)方法有 Chelex-100法、硅珠法、有機試劑提取法。其中,Chelex-100法因其操作簡便、成本低廉、DNA不易丟失和污染等優(yōu)點得到廣泛使用。但提取的 DNA雜質(zhì)多、純度不高、擴增效率不好,進行微量 DNA擴增時,往往需要對提取液進行純化濃縮。有機試劑提取法得到的 DNA純度較高,但需要生物檢材量大,轉(zhuǎn)移易丟失。硅珠法提取DNA靈敏度高、速度快,不受檢材條件影響。此外,使用一些成熟的市售試劑盒也能得到滿意的結(jié)果,如 Promega DNA IQ磁珠法和 Qiagen DNA Micro過濾柱法,此法 DNA純度高,抑制物少,但需在多管轉(zhuǎn)移,易發(fā)生污染和DNA丟失。

三、微量 DNA的擴增

對微量DNA的擴增可通過以下方法來提高檢驗的成功率:

1.增加循環(huán)次數(shù),循環(huán)次數(shù)由 28增加至 32-34[4],以提高擴增產(chǎn)物的量。Gill等[5]使用 34個循環(huán)體系,擴增模板量為 0.025ng(相當(dāng)于 4個細胞核DNA),得到了完全的 DNA圖譜;

2.增加模板 DNA的量。用 Identifiler TM25μl體系擴增,加至 4.0-6.0μl,相應(yīng)減少反應(yīng)體系水的量,以保證擴增時模板DNA的所需;

3.減少 PCR反應(yīng)體系。采用 5μl體系,可增加反應(yīng)靈敏度,提高反應(yīng)效率;

4.使用針對降解 DNA和微量DNA設(shè)計的min-Filer TM試劑盒;

5.對于擴增雜帶多的情況,可以采用 Touch Down PCR[6]方法減少非特異帶。

四、STR擴增產(chǎn)物的熒光檢測

只要做好提取和擴增,使用現(xiàn)有的基因分析儀和檢驗技術(shù),即可檢測到微量 DNA,對效果不好的檢材可以使用以下方法來提高檢驗效率。

1.在甲酰胺里增加擴增產(chǎn)物的量,提高 STR的量;

2.增大電泳儀進樣電壓和延長進樣時間;

3.使用濃縮方法,增加樣本濃度。

五、結(jié)果分析

對微量DNA進行分析,由于起始模板量少,結(jié)果會產(chǎn)生不對稱擴增、等位基因的丟失 (drop out)或增加 (drop in)、影子帶增強等問題,還有一些特異性帶的出現(xiàn),分析時應(yīng)注意,并慎重判斷。當(dāng)?shù)玫捷^低的峰值時,應(yīng)該重復(fù)實驗,在結(jié)果中出現(xiàn)兩次以上的等位基因時才能被采納。

六、案例應(yīng)用

案例 1:2007年 6月 28日,在鄭州市一出租屋的床廂內(nèi)發(fā)現(xiàn)一女尸,技術(shù)人員現(xiàn)場提取了一個快餐杯和兩個飲料瓶,要求對檢材上的唾液斑進行DNA檢驗。經(jīng)檢驗,3個檢材均得到了完整的 DNA圖譜,峰高在 1000-2000rfus,峰形可信,成為認定嫌疑人的直接重要證據(jù)。

案例 2:2007年 5月 25日,鄭州市某小區(qū)一老人在家中被害,經(jīng)家屬辨認,現(xiàn)場有一件衣服不是家庭成員所有。分局將衣服送檢,要求檢驗衣服上的脫落細胞。后在衣服貼近皮膚處檢出一完整的男性DNA圖譜,峰高在 1000-2000rfus,峰形可信。犯罪嫌疑人被抓獲后經(jīng)DNA檢驗,與該衣服上的脫落細胞 DNA比中,成為訴訟的重要證據(jù)。

[1]Beckman Ls.et al.Survey of human and ratmic rosatellite.Genomics,1992,(12).

[2]裴黎.現(xiàn)代 DNA分析技術(shù)理論與方法 [M].北京:人民公安大學(xué)出版社,2002.

[3]嚴(yán)江偉,唐暉,王靜等.DNA提取方法和 PCR循環(huán)次數(shù)對 STR擴增成功率的影響[J].中國法醫(yī)學(xué)雜志,2005,151～153.

[4]Gill P,Whitaker J Flaxman C,et al.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less 100pg of DNA.Forensic DNA International,2000,112∶17.

[5]Don R H,Cox P T,Wainwright B J,et al.“Touchdown”PCR to circumvent spurious priming during gene amplification,NuclAcids Res,1991,19(14).

DF794

A

1008-2433(2010)04-0128-02

2010-05-08

郭顯超 (1979—),男,河南鄧州人,廣東省深圳市司法鑒定專家委員會工作人員;王 磊 (1979—),男 ,河南潢川人,鄭州市公安局刑偵支隊民警;謝 華 (1977—),女,河南開封人,鄭州市公安局刑偵支隊民警。