陳子秋,肖啟賢 綜述,郭偉韜 審校

(1.廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 湛江 524032;

2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科,廣東 湛江 524001)

·綜 述·

神經(jīng)突觸研究方法的進(jìn)展

陳子秋1,肖啟賢1綜述,郭偉韜2審校

(1.廣東醫(yī)學(xué)院,廣東 湛江 524032;

2.廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨外科,廣東 湛江 524001)

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位,具有接受、整合和傳遞信息的功能,神經(jīng)元通過(guò)一級(jí)級(jí)嚴(yán)謹(jǐn)有序的方式形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。而突觸則是整個(gè)系統(tǒng)最小的功能單位,通過(guò)突觸的連接使神經(jīng)元相互之間以及神經(jīng)元和效應(yīng)器得以傳遞信號(hào)。突觸不僅是研究神經(jīng)系統(tǒng)正常電生理和功能的基礎(chǔ),同時(shí)也是研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病機(jī)制的突破口。本文就目前有關(guān)神經(jīng)突觸研究方法的概況和新進(jìn)展作一綜述。

神經(jīng)突觸;電子顯微鏡;電生理;可視熒光技術(shù)

神經(jīng)系統(tǒng)是生命活動(dòng)中起整合和調(diào)節(jié)作用的信息系統(tǒng)。神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位,具有接受、整合和傳遞信息的功能,神經(jīng)元通過(guò)一級(jí)級(jí)嚴(yán)謹(jǐn)有序的方式形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。突觸(Synapse)是神經(jīng)元之間相互接觸的部位,在反射活動(dòng)中各種神經(jīng)沖動(dòng)都要通過(guò)突觸進(jìn)行傳導(dǎo),可以說(shuō)突觸是整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)傳遞的最小功能單位,因此各種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的研究都是以突觸為突破口的。而是否能選擇一種符合研究方向的突觸檢測(cè)方法則很大程度上決定了研究的成敗。

1 形態(tài)學(xué)觀察法

經(jīng)典的突觸由突觸前部、突觸間隙和突觸后部三部分組成。突觸前部和突觸后部相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞膜較其余部位略增厚,分別稱為突觸前膜和突觸后膜,兩膜之間的狹窄間隙稱為突觸間隙。在突觸前膜部位的胞漿內(nèi),含有許多突觸小泡 (Synaptic vesicle)以及一些微絲和微管、線粒體和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。突觸小泡是突觸前部的特征性結(jié)構(gòu),小泡內(nèi)含有化學(xué)物質(zhì),稱為神經(jīng)遞質(zhì)(Neurotrans mitter)。各種突觸內(nèi)的突觸小泡形狀和大小頗不一致,是因其所含神經(jīng)遞質(zhì)不同。

觀察突觸形態(tài)最早使用的方法是普通光學(xué)顯微鏡,但是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前終末的容積一般只有 10-15L。因此,我們很難用光學(xué)顯微技術(shù)分析在整個(gè)突觸水平發(fā)生了什么,也無(wú)法輕易的分辨出神經(jīng)突觸終末的細(xì)微空間結(jié)構(gòu)[1]。但現(xiàn)在一些新的技術(shù)也逐漸用于突觸研究。

1.1 電子顯微鏡 (Electron microscope,EM)目前常用的主要有透射電子顯微鏡 (Transmission electron microscopy,TEM)、能量過(guò)濾透過(guò)式電子顯微鏡 (Energy filtered transmission electron microscopy,EFTEM)、掃描電子顯微鏡 (Scanning electron microscope,SEM)。EM主要用來(lái)觀察突觸數(shù)目和超微結(jié)構(gòu)。20世紀(jì) 50年代中期,正是電鏡應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究,突觸的結(jié)構(gòu)才被認(rèn)可。早期對(duì)樹(shù)突的電鏡觀察證實(shí)了游離核糖體和膜結(jié)合核糖體的存在。國(guó)內(nèi)有學(xué)者[2]通過(guò) TEM觀察到飲酒后的小鼠海馬CA-1區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的突觸后膜致密物質(zhì)厚度、突觸活性區(qū)長(zhǎng)度及突觸間隙寬度均顯著性變小,從而在形態(tài)學(xué)方面證明了酒精可以引起突觸的可塑性變化,并影響神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞功能甚至學(xué)習(xí)記憶。Ventura等[3]利用三維電鏡技術(shù)觀察了成年大鼠海馬 CA-1區(qū)域中星形膠質(zhì)細(xì)胞和突觸的空間位置關(guān)系,為更直觀地了解細(xì)胞的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)提供了新的工具。利用 EM觀察時(shí)不足之處是樣本必須在真空中觀察,因此無(wú)法觀察活樣本。在處理樣本時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生樣本本來(lái)沒(méi)有的結(jié)構(gòu),這加劇了此后分析圖像的難度。

1.2 原子力顯微鏡 (Atomic force microscope,AFM) AFM是一種利用原子、分子間的相互作用力來(lái)觀察物體表面微觀形貌的新型實(shí)驗(yàn)技術(shù)。它有一根納米級(jí)的探針,被固定在可靈敏操控的微米級(jí)彈性懸臂上。當(dāng)探針?lè)浅？拷鼧悠窌r(shí),其頂端的原子與樣品表面原子間的作用力會(huì)使懸臂彎曲,偏離原來(lái)的位置。根據(jù)掃描樣品時(shí)探針的偏離量或振動(dòng)頻率重建三維圖像,就能間接獲得樣品表面的形貌或原子成分。相對(duì)于掃描電子顯微鏡,原子力顯微鏡具有許多優(yōu)點(diǎn):首先,不同于電子顯微鏡只能提供二維圖像,AFM可以提供真正的三維表面圖。同時(shí),AFM不需要對(duì)樣品的任何特殊處理,如鍍銅或碳,從而避免了這種處理對(duì)樣品造成的不可逆性傷害。其次,電子顯微鏡的運(yùn)行需要在高真空條件下,而原子力顯微鏡在常壓下甚至在液體環(huán)境下都可以良好工作,這樣可以更方便的研究生物宏觀分子,甚至活的生物組織。Parpura等[4]曾用原子力顯微鏡對(duì)固定的和活的海馬神經(jīng)元進(jìn)行了成像。AFM的缺點(diǎn)在于成像范圍太小、速度慢,受探頭的影響太大。此外AFM購(gòu)買(mǎi)和維護(hù)的價(jià)格都比較高,為其普及增加了難度。

2 免疫組織化學(xué)法

指在抗體上結(jié)合熒光或可呈色的化學(xué)物質(zhì),利用免疫學(xué)原理中抗原和抗體間專一性的結(jié)合反應(yīng),檢測(cè)細(xì)胞或組織中是否有目標(biāo)抗原的存在,此方式不僅可以用來(lái)測(cè)知抗原的表現(xiàn)量,而且可觀察抗原所表現(xiàn)的位置。具有高度特異性、靈敏性和精確性。目前已發(fā)現(xiàn)的一系列突觸蛋白家族成員 (突觸蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)大部分可作為目標(biāo)抗原證明突觸的存在和位置,其中突觸素是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì),與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放直接相關(guān),有研究者建議對(duì)其檢測(cè)可作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中突觸功能建立、維持和(或)喪失、恢復(fù)的敏感指示器。然而,雖然通過(guò)辨別突觸蛋白來(lái)確認(rèn)新突觸發(fā)生已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用,但用突觸蛋白的斑點(diǎn)狀定位辨別突觸不是絕對(duì)可靠的,尤其是一些新生突觸在形成過(guò)程的早期還沒(méi)有某種突觸蛋白時(shí)更是如此,此法還存在抗體的特異性與交叉反應(yīng)的問(wèn)題。因此,對(duì)這種方法的結(jié)果應(yīng)作仔細(xì)分析。

3 可視熒光技術(shù)

功能是突觸發(fā)育成熟的標(biāo)志,可視熒光技術(shù)能進(jìn)行實(shí)時(shí)顯像,使對(duì)活體突觸功能進(jìn)行研究更為容易。熒光標(biāo)記生物膜及熒光標(biāo)記蛋白是最常見(jiàn)的可視成像技術(shù)。它能特異性地標(biāo)記突觸囊泡,發(fā)出熒光,而又不影響突觸囊泡的活性和運(yùn)轉(zhuǎn)。在突觸事件中依照熒光強(qiáng)度的變化就可以推斷相應(yīng)的神經(jīng)胞吞及胞吐的程度,跟蹤突觸囊泡運(yùn)輸循環(huán)過(guò)程。

3.1 熒光膜追蹤劑 F M1-43標(biāo)記技術(shù) F M1-43屬于苯乙烯類熒光染料中最常用的一種,是一種具有雙極性的熒光染料,親水基團(tuán)與親脂基團(tuán)分別位于分子的兩端。它可以選擇性地對(duì)正在進(jìn)行外吐和內(nèi)吞的分泌型生物膜進(jìn)行染色。FM1-43在靜息狀態(tài)下依靠其親脂尾部插入脂質(zhì)膜外葉,給予一定的外部刺激 (實(shí)驗(yàn)中一般選擇高鉀刺激或電刺激)誘發(fā)遞質(zhì)釋放后,一部分熒光染料就會(huì)隨著突觸囊泡的內(nèi)吞而成為突觸囊泡膜的一部分。刺激過(guò)后,殘留在膜外葉的剩余染料則可用洗脫液洗脫下來(lái)[5-6]。當(dāng) FM1-43游離在水溶液中時(shí),它的熒光強(qiáng)度很弱幾乎覺(jué)察不到;但當(dāng)它們被插入至疏水環(huán)境時(shí),它的熒光強(qiáng)度將呈幾十倍的增強(qiáng)[7]。因此,此時(shí)細(xì)胞內(nèi)的 FM1-43的熒光強(qiáng)度在一定程度上就可以定量地反映這一次刺激誘發(fā)下胞吞的程度。如果進(jìn)行再次刺激,苯乙烯類染料就會(huì)隨著囊泡的胞吐,與神經(jīng)遞質(zhì)一起釋放到突觸間隙,而此時(shí)熒光強(qiáng)度的減弱就可以反映出胞吐的程度。Ryan[8]用 FM1-43獲得了培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元軸突和樹(shù)突之間的突觸連接的圖像,并將其應(yīng)用在運(yùn)動(dòng)的突觸囊泡中,可在樹(shù)突及突觸體上觀察到標(biāo)記點(diǎn),通過(guò)計(jì)算熒光強(qiáng)度對(duì)突觸功能進(jìn)行分析。國(guó)內(nèi)周濤等[9]使用未分化的 PC12細(xì)胞作為種植神經(jīng)元的來(lái)源,在神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)作用下分化成神經(jīng)元樣細(xì)胞,并與原代皮質(zhì)神經(jīng)元建立模擬移植環(huán)境的共培養(yǎng)體系,利用FM1-43造影研究了細(xì)胞移植環(huán)境中宿主細(xì)胞與移植細(xì)胞突觸形成的可能性。FM1-43自身也存在一些局限性,這主要體現(xiàn)在時(shí)間分辨率較差,無(wú)法提供毫秒級(jí)的變化資料及難以排除一些來(lái)自非突觸囊泡產(chǎn)生的噪聲的干擾等方面。

3.2 Fura-2熒光探針技術(shù) Fura-2與鈣螯合劑 EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)一樣,具有四羧酸的 Ca2+螯合中心,能特異性與 Ca2+結(jié)合,不同的是 Fura-2可發(fā)出熒光,并且與 Ca2+結(jié)合后其熒光光譜發(fā)生變化。其具熒光強(qiáng)度高、波長(zhǎng)漂移、反應(yīng)速度快、自身熒光小、對(duì) Ca2+選擇性好和測(cè)定靈敏等優(yōu)點(diǎn),系目前測(cè)定細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度應(yīng)用最廣的熒光指示劑[10-11]。Fura-2可與胞漿內(nèi)游離 Ca2+結(jié)合形成 Fura-2-Ca2+復(fù)合物。Fura-2與 Fura-2-Ca2+復(fù)合物的最大激發(fā)光波長(zhǎng)分別為 380nm和340nm,其發(fā)射光的強(qiáng)度與Ca2+濃度呈正比,據(jù)此可測(cè)定 Ca2+及其變化。正常情況下突觸的傳遞過(guò)程,是神經(jīng)沖動(dòng)沿軸膜傳至突觸前膜時(shí),觸發(fā)前膜上的電壓門(mén)控鈣通道開(kāi)放,細(xì)胞外的 Ca2+進(jìn)入突觸前部,在ATP和微絲、微管的參與下,使突觸小泡移向突觸前膜,以胞吐方式將小泡內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放到突觸間隙。因此突觸內(nèi) Ca2+的濃度可反映突觸的功能活動(dòng),國(guó)內(nèi)已有學(xué)者利用 Fura-2測(cè)定突觸體胞漿游離 Ca2+濃度[12],提供了正常突觸體內(nèi) Ca2+濃度的相關(guān)數(shù)據(jù)。Fura-2熒光染料的局限性,容易受 pH、溫度、外界 Ca2+的影響,在實(shí)際操作中需注意。

3.3 谷氨酸(Glu)遞質(zhì)釋放的連續(xù)熒光分析法

中樞興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸 (Glu)從突觸前的釋放,是 Glu神經(jīng)傳導(dǎo)的重要部分,在許多 Glu釋放的分析檢測(cè)技術(shù)中,最近發(fā)展的 Glu連續(xù)熒光分析法有許多優(yōu)點(diǎn)。此法快速而靈敏度高,可對(duì) Glu釋放作動(dòng)態(tài)的檢測(cè)。原理:從突觸前膜釋放的 Glu,在谷氨酸脫氫酶 (GDH)作用下,可與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP)發(fā)生氧化還原反應(yīng),生成煙酰胺腺嘌呤二核酸(NADH)或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)以及α-酮戊二酸[13]。隨著NAD或 NADP被還原成NADH或NADPH,會(huì)引起熒光快速增加而為熒光光度計(jì)檢測(cè)到。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn) Glu的加入,可對(duì)釋放的Glu精確定量。Glu的釋放和攝取是其突觸調(diào)控中很重要的方面。含 Glu的囊泡在去極化條件下,是依賴于 Ca2+的胞泌機(jī)制釋放的[14]。Glu釋放的主要部分發(fā)生在 Ca2+內(nèi)流的平臺(tái)期,是由 Ca2+通過(guò)非失活性通道內(nèi)流而觸發(fā)的。通過(guò)對(duì)突觸體 Glu釋放的分析,不僅為檢測(cè)突觸功能提供了另一可靠指標(biāo),也為研究神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病提供了有效的研究方法。例如朱曉峰等[15]研究致癇劑馬桑內(nèi)酯對(duì)谷氨酸攝取和釋放功能的影響,闡明了馬桑內(nèi)酯致癇的可能機(jī)制是使谷氨酸釋放增加,攝取減少,突觸間隙谷氨酸聚積所造成。隨著分析、檢測(cè) Glu釋放技術(shù)的發(fā)展,不但可以探明 Glu從突觸前膜的釋放機(jī)制這一神經(jīng)生物學(xué)上的重要問(wèn)題,而且也能提供一種更便捷的方法,去研究在不影響 Glu的正常神經(jīng)傳導(dǎo)條件下,對(duì) Glu異常釋放,造成對(duì) Glu受體的濫刺激所致神經(jīng)毒性的拮抗。

3.4 綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein,GFP) 隨著光學(xué)顯微鏡的發(fā)展,熒光標(biāo)記蛋白技術(shù)已成為許多活體成像研究中必不可少的一種工具。許多學(xué)者將其應(yīng)用于活體細(xì)胞突觸形成的研究,其中應(yīng)用最廣泛的熒光標(biāo)記蛋白為綠色熒光蛋白(GFP)。它是一種功能獨(dú)特的蛋白質(zhì),編碼 238個(gè)氨基酸殘基,分子量為 2688Da。該蛋白受到紫外或藍(lán)光激發(fā)時(shí)可以自身催化形成發(fā)色結(jié)構(gòu)并發(fā)出綠色熒光,其吸收波長(zhǎng)為 395nm,發(fā)射波長(zhǎng)為 509nm,從而可以被多種方法檢測(cè)。與其他熒光標(biāo)記蛋白不同,GFP檢測(cè)不需要底物,在加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活。Ahmari等[16]將GFP標(biāo)記突觸前囊泡相關(guān)膜蛋白,又稱突觸小泡蛋白(Synaptobrevin)。利用實(shí)時(shí)熒光顯像技術(shù)發(fā)現(xiàn)突觸前囊泡在神經(jīng)元與它接觸的部位接觸前就可以識(shí)別到,一旦神經(jīng)元和它潛在的靶細(xì)胞建立實(shí)質(zhì)性的接觸,這些囊泡就會(huì)在突觸形成部位進(jìn)行逐步釋放。此外,還可將 GFP作為蛋白質(zhì)標(biāo)簽 (Protein tagging),即利用DNA重組技術(shù),將目的基因與 GFP基因構(gòu)成融合基因,轉(zhuǎn)染合適的細(xì)胞進(jìn)行表達(dá),然后借助熒光顯微鏡觀察活體細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記的蛋白質(zhì)位置和動(dòng)態(tài)變化。Hartmann等[17]將綠色熒光蛋白 (GFP)標(biāo)記腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)構(gòu)建 GFP-BDNF融合蛋白的質(zhì)粒,然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元,通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)海馬神經(jīng)元間谷氨酸型突觸部位 GFP-BDNF囊泡中熒光強(qiáng)度的變化來(lái)研究綠色熒光蛋白標(biāo)記的BDNF的分泌情況。研究發(fā)現(xiàn)高頻刺激能激發(fā)谷氨酸型突觸囊泡中BDNF的釋放,并且這種釋放依賴于突觸后離子移變谷氨酸受體及突觸后鈣離子內(nèi)流的激活。GFP熒光檢測(cè)的一大缺點(diǎn)就是沒(méi)有放大作用,它不能像酶一樣通過(guò)加工無(wú)數(shù)的底物分子而將信號(hào)放大。因此 GFP靈敏度可能低于某些酶類報(bào)告蛋白,此外,檢測(cè)的靈敏度還有待進(jìn)一步提高;熒光強(qiáng)度的非線性性質(zhì)使其定量非常困難。不過(guò)相信隨著通過(guò)對(duì) GFP基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,一系列帶有不同的激發(fā)和發(fā)散波長(zhǎng)的GFP突變株的開(kāi)發(fā),以及隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)方法的不斷完善,GFP標(biāo)記系統(tǒng)將比現(xiàn)有的標(biāo)記系統(tǒng)具有更多的優(yōu)勢(shì)。

4 電生理方法

神經(jīng)突觸的主要功能就是傳遞信息。信息傳遞的基本過(guò)程是突觸前神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)介質(zhì),神經(jīng)介質(zhì)作用于突觸后膜上的受體,引起動(dòng)作電位。因此,在神經(jīng)突觸發(fā)育的研究中電生理指標(biāo)有其特殊的重要性,電生理方法也是研究突觸是否具有成熟功能的最有效的方法。早期研究多使用電壓鉗技術(shù)。目前,應(yīng)用最廣泛的是 Sakmann和 Neher[18]于1976年建立的膜片鉗技術(shù) (Patch clamp recording technique)。其突出優(yōu)點(diǎn)是能夠在維持細(xì)胞興奮過(guò)程中膜電位恒定的同時(shí),直接記錄離子通道電流,反映單一的或多個(gè)的離子通道分子活動(dòng)。其基本原理是用微玻管電極接觸細(xì)胞膜,以千兆歐姆以上的阻抗使之封接,使與電極尖端開(kāi)口處相接的細(xì)胞膜小區(qū)域 (膜片)與細(xì)胞膜其他部分在電學(xué)上絕緣,在此基礎(chǔ)上固定電位,并對(duì)此膜片上離子通道的離子電流進(jìn)行監(jiān)測(cè)記錄,以此來(lái)反映細(xì)胞膜上單一的或多個(gè)的離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)。膜片鉗主要有以下幾種記錄模式:細(xì)胞吸附模式、膜內(nèi)面向外模式、膜外面向外模式、全細(xì)胞模式、穿孔膜片模式、開(kāi)放細(xì)胞吸附式、穿孔囊泡模式等。其中最常用的是全細(xì)胞記錄模式。Song等[19]報(bào)道,把 GFP敲入 (GFP+)的成體神經(jīng)干細(xì)胞和新生鼠海馬區(qū)原代的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元在無(wú)血清培養(yǎng)基中共同培養(yǎng) 2-4周,在第 6天時(shí)加入阿糖胞苷,以選擇非有絲分裂的神經(jīng)元。在共同培養(yǎng)兩周時(shí),電鏡檢查發(fā)現(xiàn) GFP+神經(jīng)元和原代培養(yǎng)的神經(jīng)元既形成了對(duì)稱性的突觸結(jié)構(gòu),又形成了非對(duì)稱性的突觸結(jié)構(gòu)。全細(xì)胞膜片鉗記錄在注入去極化電流 (0.5-1nA)條件下可以反復(fù)激發(fā)動(dòng)作電位的發(fā)生,且能夠被 0.5μmol/L的河豚毒素 (Tetrodotoxin,TTX)所阻斷。Ullian等[20]在培養(yǎng)兩周后的大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞 (Retinal ganglion cells,RGCs)測(cè)量到其由膠質(zhì)細(xì)胞引起的自發(fā)突觸活性的顯著增高。

電生理實(shí)驗(yàn)方法也有一些欠缺和不便之處,如膜片鉗需要干凈的細(xì)胞膜表面,因此對(duì)細(xì)胞條件要求較高,且會(huì)破壞細(xì)胞的正常代謝和細(xì)胞骨架等。膜片鉗技術(shù)如果能進(jìn)一步改良,在體內(nèi)環(huán)境中不改變細(xì)胞生理狀態(tài)的情況下檢測(cè)細(xì)胞的電生理特性,則能夠更準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的生存狀態(tài),評(píng)價(jià)細(xì)胞的突觸生理功能,為神經(jīng)干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用及移植后評(píng)價(jià)提供更為可靠的客觀依據(jù)。

5結(jié)語(yǔ)及展望

雖然本文將突觸的研究方法分開(kāi)介紹,但在神經(jīng)突觸發(fā)生發(fā)育的相關(guān)研究中往往需要多種方法的綜合運(yùn)用,沒(méi)有超微結(jié)構(gòu)的詳細(xì)觀察,對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸發(fā)生和發(fā)育的描述就不夠完善;而缺乏相應(yīng)的電生理功能的研究,結(jié)構(gòu)觀察的任何結(jié)果也不完全可信。譬如上述的膜片鉗技術(shù)和其他方法的結(jié)合,如和膜通道蛋白重組技術(shù)、同位素示蹤技術(shù)和光譜技術(shù)結(jié)合起來(lái),可以協(xié)同對(duì)離子通道進(jìn)行全面而深入的研究;如和單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Single cell RT-PCR)的結(jié)合,可以從電生理學(xué)角度和分子生物學(xué)角度揭示神經(jīng)干細(xì)胞(神經(jīng)元)的功能活動(dòng)與結(jié)構(gòu)之間的聯(lián)系,檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞上離子通道的藥理學(xué)和生物學(xué)特性,在同一個(gè)細(xì)胞上篩選出某些特定mRNA的表達(dá),從而在基因水平鑒定形態(tài)相似而功能不同的細(xì)胞。因此,若要全面深入地了解神經(jīng)突觸的發(fā)生和發(fā)育進(jìn)行就需要綜合以上手段,進(jìn)行多模式研究。目前國(guó)內(nèi)已有報(bào)道用納米電極監(jiān)測(cè)囊泡及及突觸內(nèi)神經(jīng)信號(hào)的分子傳導(dǎo)[21]。

隨著神經(jīng)系統(tǒng)生理和病理機(jī)制研究的不斷深化,對(duì)突觸功能更加詳盡的闡述將成為該領(lǐng)域的關(guān)鍵性問(wèn)題。我們也更加期待更新、更先進(jìn)、更完善的檢測(cè)工具或檢測(cè)方法的誕生。

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R338.1+3

A

1003—6350(2010)19—122—04

廣東省自然科學(xué)基金(編號(hào):8452402301001081)

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金項(xiàng)目(編號(hào):WSTJJ20081030410305196909162017)

陳子秋(1984—),男,湖北省十堰市人,在讀碩士研究生。

2010-06-22)