王麗娟，張媛媛

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展

王麗娟，張媛媛

（赤峰學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中,具有多種生物學(xué)特性及分離、培養(yǎng)的方法,在適宜的微環(huán)境里具有多向分化潛能.本文就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化的最新進(jìn)展做一綜述.

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；分離；培養(yǎng)；誘導(dǎo)分化

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓中除造血干細(xì)胞外的另一類具有高度可塑性的細(xì)胞群體,在特定的誘導(dǎo)條件下可以向中胚層細(xì)胞如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞；外胚層的神經(jīng)細(xì)胞；內(nèi)胚層的肝細(xì)胞分化,以滿足基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用,同時具有易在體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)和擴(kuò)增等特性,被認(rèn)為在基因治療、細(xì)胞治療、組織工程等領(lǐng)域具有廣泛的臨床應(yīng)用前景.現(xiàn)就骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BM-MSCs）的分離、培養(yǎng)及其誘導(dǎo)分化的最新進(jìn)展做一綜述.

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)特征

原代接種后約24h后就見有細(xì)胞貼壁，此時貼壁的細(xì)胞為單個,形態(tài)大部分為圓形，首次換液后5～7d可見由幾十個到數(shù)百個細(xì)胞組成的集落,細(xì)胞形態(tài)呈梭形、三角形或星形.原代細(xì)胞培養(yǎng)10d左右,細(xì)胞快速增殖,每個集落中的細(xì)胞不斷增殖呈“漩渦狀”,培養(yǎng)2周左右,每個小集落形成約數(shù)百致上千個細(xì)胞的大集落,集落交界處出現(xiàn)重疊、融合.傳代后的mmSCs增殖能力不斷增加.

1.2 超微結(jié)構(gòu)

透射電鏡下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)不一，多為圓形，可見核仁，核漿比例大，胞質(zhì)內(nèi)有分泌小泡，細(xì)胞器少，為低分化的幼稚細(xì)胞.

目前骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并沒有找到理想的特異性標(biāo)志,它既有間質(zhì)細(xì)胞的表面抗原,又有內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞的表面抗原,但不表達(dá)造血細(xì)胞的表面標(biāo)志,如CD34、CD45、CD14、CD3、CD4、 CD8等,也不表達(dá)與人白細(xì)胞抗原(HLA)識別有關(guān)的共刺激分子B71、B72及主要組織相容性復(fù)合物Ⅱ類分子如HLA-DR抗原等，低表達(dá)：CD11b、CD54、CD106等，高表達(dá)：CD29、CD44、CD49e、CD105、CD13、CD48、CD71、CD56、CD90、CD166.在自然生長情況下,即使是1個細(xì)胞形成的克隆,其基因表達(dá)也呈多種細(xì)胞的表達(dá)特征.不同來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有不同的生物學(xué)性質(zhì).標(biāo)本來源、分離方法不同導(dǎo)致獲得的細(xì)胞群不同,檢測的細(xì)胞代次不同或培養(yǎng)基存在差異等種種因素,導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞獲得或失去某些表面標(biāo)記物表達(dá)的可能性不可排除.目前,Martinez等提出,正常骨髓中MSCs是惟一表達(dá)神經(jīng)節(jié)苷脂-2(GD2)的細(xì)胞,因而GD2是第1個被報道的區(qū)分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和其他骨髓細(xì)胞的單一標(biāo)志.這預(yù)示著GD2在對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用上將有重要價值.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞必須具備的特征是:體外培養(yǎng)時呈成纖維樣集落形成單位,并貼壁生長,以及能夠自我更新、分化為3種以上間質(zhì)細(xì)胞系.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞周期研究表明,僅有10%MSCs處于S+G2+M期而絕大部分細(xì)胞停滯在G0+G1期.

2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞最初的分離培養(yǎng)方法是由Friedenstein在70年代中期建立的.目前從體內(nèi)分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞常用的方法有5種:全骨髓貼壁分離法、密度梯度離心法、紅細(xì)胞裂解液分離法、特制培養(yǎng)板篩選法、流式細(xì)胞儀分離和免疫磁珠分離法.

2.1 貼壁分離法

全骨髓貼壁細(xì)胞分離法是根據(jù)骨髓中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長,而造血系細(xì)胞懸浮生長的特性對二者進(jìn)行分離,每次換液去除懸浮生長的造血細(xì)胞；傳代時利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞較淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞易脫落的特點(diǎn),保證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在短時間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開,而淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞因貼壁較強(qiáng)仍貼附于培養(yǎng)瓶底，從而使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞得到進(jìn)一步純化.貼壁培養(yǎng)法具有操作簡便、快速、細(xì)胞在離體后很少有分離所造成的損傷等優(yōu)點(diǎn),但由于骨髓中大量的造血干細(xì)胞與骨髓單個核細(xì)胞中含量極低的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一起培養(yǎng)，細(xì)胞的成分復(fù)雜，需經(jīng)多次換液去除懸浮未貼壁細(xì)胞，影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁及觀察.

全骨髓貼壁分離法是將骨髓液注入等體積的Hanks液中，4℃1000r/min離心5min，棄上清，用Hanks液重復(fù)洗滌后培養(yǎng).

2.2 密度梯度離心法

密度梯度離心法即根據(jù)骨髓中細(xì)胞成分比重的不同,提取單個核細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng),單個核細(xì)胞包括干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，其體積、形態(tài)和密度與其他細(xì)胞不同，一般認(rèn)為,干細(xì)胞在形態(tài)上為淋巴細(xì)胞,其密度與淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞的密度基本相同,分離干細(xì)胞以密度為1.077±0.001的分層液最佳，常用的分層液有Ficoll和Percoll兩種.

本文從移動互聯(lián)網(wǎng)的發(fā)展需求為落腳點(diǎn)，對基于LISP協(xié)議環(huán)境下的虛擬化方案進(jìn)行了研究，并在此基礎(chǔ)上給出了兩種優(yōu)化方案，基于LISP協(xié)議的網(wǎng)絡(luò)虛擬化具有很多優(yōu)勢，例如：保證LISP節(jié)點(diǎn)能夠和其他LISP移動之間互通等，但也有缺點(diǎn)，例如對映射服務(wù)器要求較高，因此還有待進(jìn)一步研究。

2.2.1 Ficoll分離液法

Ficoll密度梯度分離法抽取Ficoll分離液（相對密度為1.077）5.0ml,將取得骨髓液輕輕鋪于離心液上,2000r p m離心25min,此時離心管出現(xiàn)四個層面,小吸頭輕輕吸取第二層乳白色單個核細(xì)胞層.

2.2.2 Percoll分離液法

Percoll密度梯度分離法是將相當(dāng)于2倍骨髓液體積的1.073g/ml Percoll分離液加入15ml無菌離心管內(nèi)，再將抗凝的骨髓沿管壁緩慢加至分離液面上，4℃800r/min離心30min，吸取分離液面上的白色云霧狀單個核細(xì)胞層.

2.3 紅細(xì)胞裂解液分離法

有人用紅細(xì)胞裂解液溶解骨髓中的紅細(xì)胞后獲得單個核細(xì)胞.鄧近平等進(jìn)一步證實(shí)采用紅細(xì)胞裂解液處理骨髓后再行接種，能提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的貼壁效率，同時不影響其貼壁后的生長，是一種可行的分離方法.

2.4 特制培養(yǎng)板篩選法

利用MSCs的形態(tài)大小及貼壁時間的特性,設(shè)計一特殊的培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)篩選,培養(yǎng)皿內(nèi)套有直徑為3μm小孔的板,培養(yǎng)5～7d時在孔板上面貼壁的細(xì)胞即為MSCs,純度可達(dá)90%以上.

2.5 免疫磁珠或流式細(xì)胞儀分離法

通過MSCs表面帶有或缺失的抗原成分進(jìn)行正選或負(fù)選,從而獲得相對純化的MSCs.單克隆抗體磁珠分離系統(tǒng)或流式細(xì)胞儀技術(shù)對細(xì)胞活性影響較大,而且實(shí)驗(yàn)條件要求高,需要骨髓量大,從一個部位每次抽取的骨髓的量不應(yīng)超過2ml,否則將因吸出物中血量的增加引起有核細(xì)胞明顯減少.

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對營養(yǎng)條件要求高，而且含量很低，約為0.001%～0.01%，要利用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞就必需實(shí)現(xiàn)其體外分離培養(yǎng)及擴(kuò)增.王忠瓊等用含10%胎牛血清的DMEM-L G培養(yǎng)BM-MSCs，3d后首次換液,以后每2～3d換液1次,待細(xì)胞生長至瓶底80%～90%融合時,按1：2～3比例傳代培養(yǎng).馬力等將分離的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106，分別加Mesencult干細(xì)胞培養(yǎng)基、DMEM/F 12培養(yǎng)基、L-DMEM培養(yǎng)基，各組培養(yǎng)基中均含有20%的胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素，置于C O2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3種不同培養(yǎng)液培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示各組細(xì)胞均生長狀態(tài)良好，在細(xì)胞活性、增殖速度、貼壁率、均質(zhì)性方面Mesencult培養(yǎng)液略優(yōu)于DMEM/F 12、L G-DMEM培養(yǎng)液，但差異無著性意義.周新伏等分別用含10%臍帶血清、胎牛血清(F C S)、成人血清的DMEM/F 12培養(yǎng)基和Mesencult培養(yǎng)基培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)臍帶血清與Mesencult組培養(yǎng)的BM-MSCs的純度和體外誘導(dǎo)分化能力,優(yōu)于F C S和A B型血清組,臍帶血清適合臨床應(yīng)用.總之，不同培養(yǎng)基、不同質(zhì)和量的血清、不同的種植密度、首次換液時間、都會影響MSCs的生長.大多數(shù)的學(xué)者都采用低糖DMEM培養(yǎng)BM-MSCs.

4 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化

BM-MSCs的多向分化潛能被認(rèn)為是其最重要的生物學(xué)特征.研究表明,在不同的誘導(dǎo)條件下BM-MSCs能夠向不同的譜系分化，不僅可分化為間質(zhì)組織如成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和肌肉細(xì)胞等，而且可以跨胚層分化.

4.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化

劉廠輝等[12]發(fā)現(xiàn)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPAR γ）基因在MSC向脂肪細(xì)胞分化的早期中起重要的正向調(diào)節(jié)作用,并促進(jìn)脂肪分化相關(guān)蛋白(ADRP)基因和蛋白的表達(dá)，PPAR γ基因過表達(dá)可增強(qiáng)MSC向脂肪細(xì)胞分化的能力,縮短分化進(jìn)程,提高分化效率,可能與增強(qiáng)ADRP的表達(dá)有關(guān).徐道華等利用內(nèi)含3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、地塞米松、不同濃度的胰島素及胎牛血清的DMEM定向誘導(dǎo)BM-MSCs，發(fā)現(xiàn)10mg/L胰島素、0.1mm o l/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.1mm o l/L吲哚美辛、0.1um o l/L地塞米松、體積分?jǐn)?shù)為0.1胎牛血清的DMEM分化誘導(dǎo)液定向誘導(dǎo)可獲得較好的成脂分化效果.徐無忌等不但用成脂誘導(dǎo)液將BM-MSCs成功誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞，而且還發(fā)現(xiàn)中藥骨康含藥血清可抑制成脂誘導(dǎo)劑對BM-MSCs向脂肪細(xì)胞分化的促進(jìn)作用.

4.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞的分化

BM-MSCs在體內(nèi)可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞.蘇平等用銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)的BM-MSCs，用膜片鉗全細(xì)胞記錄方式檢測細(xì)胞內(nèi)外的離子通道電流，發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B誘導(dǎo)的MSCs,不僅具有神經(jīng)細(xì)胞的外形和免疫學(xué)特征,而且具有神經(jīng)元的基本電生理功能.袁維等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因能成功的轉(zhuǎn)染BM-MSCs并有效表達(dá)，轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)型綠色熒光蛋白-骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能常規(guī)培養(yǎng)，持續(xù)3個月仍能穩(wěn)定地表達(dá)綠色熒光.轉(zhuǎn)染后BM-MSCs在DMSO、BHA等試劑定向誘導(dǎo)后，獲得的神經(jīng)細(xì)胞存活時間較長，觀察至第7天仍有10%神經(jīng)元樣細(xì)胞存活.誘導(dǎo)5h后部分增強(qiáng)型綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞便可轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元樣細(xì)胞，并有軸突和樹突出現(xiàn)；誘導(dǎo)24h后絕大多數(shù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞都可分化為神經(jīng)元，且多個神經(jīng)元之間可形成網(wǎng)絡(luò)，說明轉(zhuǎn)染后的BM-MSCs的生物學(xué)性狀沒有發(fā)生改變.有的學(xué)者用丹參注射液在體外將大鼠BM-MSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞.也有報道分別用鼠腦C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞上清液和大腦皮層細(xì)胞條件培養(yǎng)液促進(jìn)BM-MSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化.

4.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化

徐洪軍等將成年大鼠BM-MSCs在20μg/L肝細(xì)胞生長因子的誘導(dǎo)下，甲胎蛋白細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色培養(yǎng)第7天即出現(xiàn)陽性，第14天清蛋白和細(xì)胞角蛋白18免疫組織化學(xué)染色陽性，分化為肝細(xì)胞.胡晶等用成纖維生長因子-2(FGF-2)在體外定向誘導(dǎo)大鼠BM-MSCs，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后BM-MSCs由棱形向多角形、卵圓形方向變化，白蛋白、CK19和糖原12d即有陽性表達(dá),以后隨誘導(dǎo)時間的延長陽性率逐漸升離.20n g/mlFGF-2誘導(dǎo)比10n g/mlFGF-2誘導(dǎo)細(xì)胞白蛋白、CK19和糖原的表達(dá)量均多.20n g/mlFGF-2具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)地分化的能力.目前，體外誘導(dǎo)BM-MSCs向肝細(xì)胞分化主要使用以下誘導(dǎo)因子：肝細(xì)胞生長因子、FGF、表皮生長因子等.但是,體外誘導(dǎo)BM-MSCs分化為肝細(xì)胞的關(guān)鍵因素是什么？哪一種因子誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率更高這些都尚未完全明了.

5 存在的問題及展望

近年來關(guān)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的研究有了較大發(fā)展，但將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用于臨床，仍面臨許多問題:（1）不同個體之間存在著生物學(xué)差異,各個實(shí)驗(yàn)室條件參差不齊,分離純化細(xì)胞群的技術(shù)有待進(jìn)一步提高;（2）從已有報道來看，尚沒有哪種方法能在體外將BM-MSCs全部誘導(dǎo)分化為所需的功能細(xì)胞，如何提高誘導(dǎo)BM-MSCs向功能細(xì)胞分化的分化率尚需進(jìn)一步探討;（3）骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)僅限于自體移植方面，在異體移植免疫反應(yīng)問題上有待進(jìn)一步探索.

隨著三維細(xì)胞培養(yǎng)移植模型的進(jìn)一步發(fā)展、基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的完善和生物可降解材料的日趨成熟，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植將有更廣闊的前景，骨缺損、骨不連的治療將進(jìn)入一個工程化修復(fù)重建的嶄新領(lǐng)域.

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1673-260X（2010）03-0070-03