張義偉

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是利用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的機(jī)制，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法，是控制藥品質(zhì)量的一項(xiàng)重要檢測項(xiàng)目。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查包括兩種方法，即凝膠法和光度測定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì)法［1］。其中廣泛使用的權(quán)威的方法是凝膠法。隨著細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系統(tǒng)工程的標(biāo)準(zhǔn)化，藥品越來越多的家兔熱原檢查法被細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所取代。筆者根據(jù)實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)，歸納在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中的幾點(diǎn)體會(huì)，以資參考。

1 影響細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的因素

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查操作過程應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作法，防止微生物的污染。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持潔凈，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)紫外燈滅菌1 h，在百級(jí)凈化臺(tái)上操作，動(dòng)作盡量輕、小，防止試管受到振動(dòng)。檢查所用器皿均應(yīng)徹底洗滌干凈，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250℃干烤至少60 min。凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.015 ml～1。某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液，一般要求供試品溶液的PH值在6.0～8.0的范圍內(nèi)［2］。在此范圍內(nèi)才能形成最佳凝集，PH值過高或過低均可破壞極微量的內(nèi)毒素，也可影響鱟試劑與內(nèi)毒素凝集反應(yīng)過程。對(duì)于過酸、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液(或其稀釋液)的PH值。試液的每一步稀釋應(yīng)在旋渦混合器上混勻?？傊?，盡可能避免假陽性或假陰性結(jié)果。

2 內(nèi)毒素限值的確定

一個(gè)新品種的內(nèi)毒限值確定的妥當(dāng)與否，直接決定了對(duì)藥品本身所允許的內(nèi)毒素含量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量的評(píng)價(jià)要求［3］。盡管細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的建立是一個(gè)科學(xué)方法的研究過程，但其最終目的還是要為控制藥品質(zhì)量服務(wù)。因此，在方法建立時(shí)，不但要闡明限值的合理性，考慮技術(shù)可能達(dá)到的限值，同時(shí)還要滿足相關(guān)藥品管理法規(guī)的要求。標(biāo)準(zhǔn)要求太高可能會(huì)使正式生產(chǎn)時(shí)很多產(chǎn)品不能通過檢查，從而造成不必要的浪費(fèi)，太松則不能保證藥品質(zhì)量，危及臨床用藥安全。細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)一般按以下公式確定，L=K/M。K為人每公斤體質(zhì)量每小時(shí)最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以Eu/(kg· h)表示，注射劑K=5Eu/(kg·h);M為人用每公斤體質(zhì)量每小時(shí)的最大供試品劑量，以ml/(kg·h)、mg/(kg·h)或u/(kg·h)表示，人均體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，注射時(shí)間若不足1 h，按1 h計(jì)算。在計(jì)算過程中應(yīng)注意單位的一致性。在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品和鱟試劑常常以Eu/ml表示，所以具體實(shí)驗(yàn)中樣品的內(nèi)毒素限值可以轉(zhuǎn)換為Eu/ml的。如某產(chǎn)品的內(nèi)毒素限值為0.1Eu/mg，濃度為100 mg/ml，內(nèi)毒素限值L=0.1(Eu·mg)·100(mg· ml)=10Eu/ml。注射劑臨床應(yīng)用很多品種是聯(lián)合用藥，如一瓶輸液中可能加入多種藥物，也有幾瓶輸液同時(shí)注射。因此，在實(shí)險(xiǎn)室對(duì)新品種內(nèi)毒素理論限值計(jì)算后，還應(yīng)結(jié)合多種因素，綜合考慮其內(nèi)毒素限值的確定，這一點(diǎn)是很多藥學(xué)工作者所忽略的。

3 應(yīng)注意細(xì)菌內(nèi)毒素的“迭加現(xiàn)象”

試驗(yàn)中使用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水或其他材料均可能存在少量內(nèi)毒素，但只要不超過鱟試劑的靈敏度，就不能檢出，然而它可增加供試品中含有的內(nèi)毒素量，使其剛好在靈敏度限值以上，引起陽性反應(yīng)。盡管出現(xiàn)這種“假陽性實(shí)驗(yàn)”的情況是不可避免的，但可采用至少比供試品內(nèi)毒素限值更小的鱟試劑來檢查細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水或其他材料，減少這種“假陽性實(shí)驗(yàn)”的出現(xiàn)。這種供試品的“假陽性實(shí)險(xiǎn)”反應(yīng)是安全的，因?yàn)楣┰嚻繁旧泶嬖趦?nèi)毒素含量低于限值，它與含有超過內(nèi)毒素限值，而被錯(cuò)誤的通過是不同的。

4 錯(cuò)誤認(rèn)為一定要按最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)或最小有效濃度(MVC)進(jìn)行試驗(yàn)

實(shí)際上，有的樣品濃度很高也不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)。這種情況下，只要供試品內(nèi)毒素含量合格，可以在MVD范圍之內(nèi)，即小于MVD的倍數(shù)下進(jìn)行試驗(yàn)，又如對(duì)樣品檢查時(shí)，也可以先用原液進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，如無干擾，內(nèi)毒素檢查也能合格，則不必進(jìn)行稀釋。這樣做的直接好處是可以節(jié)約成本和時(shí)間，減少污染環(huán)節(jié)。因此通過干擾實(shí)險(xiǎn)，找到一個(gè)適當(dāng)?shù)牟桓蓴_試驗(yàn)的供試品濃度，從而使操作更為便捷、經(jīng)濟(jì)。

5 試驗(yàn)結(jié)果的判斷

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查須陰性對(duì)照溶液均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液和陽性對(duì)照溶液均為陽性，試驗(yàn)方為有效。供試品溶液管均為陰性，判供試品符合規(guī)定，如均為陽性，判供試品不符合規(guī)定。若有一管為陰性，另一管為陽性，需進(jìn)行復(fù)試。復(fù)試時(shí)供試品溶液需做4支平行管，若均為陰性，判供試品符合規(guī)定，否則判供試品不符合規(guī)定。

［1］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典(二部).化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄 85-87

［2］郭錄平.淺談?dòng)绊戺c試驗(yàn)的影響因素.中國藥學(xué)雜志，1996，31(3):187.

［3］周孝文，李波.細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法常見問題.中國藥學(xué)雜志，2006，41(19):1516.