高全立 汪萍

河南省腫瘤醫(yī)院生物治療科，*血液科，河南 鄭州450008

腫瘤干細(xì)胞理論提出在腫瘤組織中存在有少量腫瘤干細(xì)胞。類(lèi)似于正常干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞也具有自我復(fù)制和分化功能，對(duì)傳統(tǒng)的治療方法如放療和化療不敏感，它們是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源［1］。最近幾年的研究證實(shí)在多種腫瘤中存在有腫瘤干細(xì)胞［2］。乳腺癌干細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞是較早發(fā)現(xiàn)的實(shí)體腫瘤干細(xì)胞，對(duì)它們的生物學(xué)特性已有比較深入的研究［3-4］。肺癌無(wú)論在我國(guó)和全球都是發(fā)病率和病死率最高的腫瘤，然而關(guān)于人肺癌干細(xì)胞研究的文獻(xiàn)非常少，僅有少數(shù)幾篇文獻(xiàn)報(bào)道CD133為肺癌的干細(xì)胞標(biāo)記［5］。為了研究小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性，我們應(yīng)用新型無(wú)血清培養(yǎng)基從新鮮切除的肺癌組織中培養(yǎng)了原代腫瘤細(xì)胞，并成功傳代建立了細(xì)胞系。應(yīng)用流式細(xì)胞分析及分選技術(shù)，我們首次鑒定出CD44及CD90可能為小細(xì)胞肺癌的干細(xì)胞標(biāo)記，并對(duì)它們的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 Defined K-SFM 無(wú)血清培養(yǎng)基、Ⅱ型膠原酶、RPMI 1640、PBS、TrypLEEMExpress等購(gòu)自Invitrogen 公司。超低黏附的96孔培養(yǎng)板、普通培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板均購(gòu)自Corning公司。EGF（表皮生長(zhǎng)因子）和bFGF（堿性成纖維生長(zhǎng)因子）購(gòu)自Peprotech公司。CD44-FITC、CD90-APC及相應(yīng)的同型對(duì)照抗體購(gòu)自BD公司。

1.2 原代細(xì)胞的培養(yǎng)及建系 新鮮手術(shù)切除的肺癌組織，在6孔板中用含青霉素及鏈霉素的RPMI 1640反復(fù)沖洗并剔除壞死組織后，用無(wú)菌剪刀反復(fù)剪切成約1 mm3大小的組織塊。收集剪切后的腫瘤組織置于底面積為25 cm2的培養(yǎng)瓶中，用含有Ⅱ型膠原酶400 U/mL的Defined K-SFM 無(wú)血清培養(yǎng)基在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中37 ℃消化3 h后，倒置顯微鏡下觀察大部分細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞，用RPMI 1640洗滌，300×g離心3次徹底去除膠原酶。收集消化后的肺癌細(xì)胞，用含EGF 20 ng/mL、bFGF 10 ng/mL 的Defined K-SFM培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在含CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)，每3天換新鮮培養(yǎng)基1次。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合時(shí)，用TrypLEEMExpress消化后傳代。培養(yǎng)的前4代細(xì)胞在傳代時(shí)每次都保留部分細(xì)胞凍存于液氮中。

1.3 免疫組織化學(xué) 將培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化后收集到離心管中，500×g離心10 min。去除上清液后在細(xì)胞團(tuán)中加入2滴血漿和凝血酶混勻1 mim。血漿凝固后加入4%的甲醛固定30 mim，細(xì)胞團(tuán)取出后用石蠟包埋。然后用常規(guī)的免疫組化方法檢測(cè)P53、CK5、CD44和AE1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.4 流式細(xì)胞學(xué)分析及分選腫瘤干細(xì)胞 于75 cm2培養(yǎng)瓶中原代培養(yǎng)后取傳代在4代以?xún)?nèi)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞，PBS沖洗2次后，加入2 mL的TrypLEEMExpress室溫消化6 min。收集消化后的單個(gè)細(xì)胞，PBS洗滌2次，調(diào)細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/mL，分別加入CD133-FITC及CD90-APC抗體溫育20 min，最后用RPMI 1640 洗滌2次。用1 mL的RPMI1640懸浮細(xì)胞，過(guò)40 μm的無(wú)菌篩網(wǎng)，加PI至終濃度為1 μg/mL放置冰上待分析分選。在同樣的條件下標(biāo)記同型對(duì)照抗體細(xì)胞組。

應(yīng)用FACSAria Ⅱ流式細(xì)胞儀 （美國(guó)BD Bioscience公司）分析分選待檢的細(xì)胞。細(xì)胞樣品上機(jī)后，收集5萬(wàn)個(gè)細(xì)胞應(yīng)用BD FACSDiva軟件分析。首先根據(jù)細(xì)胞的前向角和側(cè)向角特性，圈出為單個(gè)且有活性的細(xì)胞群，再進(jìn)一步圈出PI-的細(xì)胞群，對(duì)比同型對(duì)照抗體組的細(xì)胞，依據(jù)不同抗體的熒光標(biāo)記特性，圈出所要分析的細(xì)胞。最后將所選的細(xì)胞無(wú)菌分選到分選管中。

1.5 單細(xì)胞克隆形成試驗(yàn) 用流式細(xì)胞儀將單個(gè)細(xì)胞直接分選到96孔板中，每孔1個(gè)細(xì)胞，用200 μL/孔的Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種細(xì)胞設(shè)120個(gè)復(fù)孔。分選后用倒置顯微鏡觀察，將只含有1個(gè)細(xì)胞的孔標(biāo)記。以后每3天換液1次，定期觀察各孔中形成細(xì)胞克隆的特性并計(jì)數(shù)照相。

1.6 平板集落形成試驗(yàn) 流式細(xì)胞儀分選的細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種到6孔板中，每孔250個(gè)細(xì)胞，用2 mL的Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。以后每隔3天換液1次，并定期用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞形成集落的狀況。當(dāng)大部分集落增長(zhǎng)的細(xì)胞數(shù)目大于100個(gè)時(shí)，停止培養(yǎng)并用結(jié)2%的結(jié)晶紫染色。具體染色步驟為：先用PBS小心沖洗細(xì)胞1次，4%甲醛室溫固定30 min，PBS再?zèng)_洗2次，2%結(jié)晶紫染色1 h，清水沖洗后照相并計(jì)數(shù)每孔中細(xì)胞集落的數(shù)目。

1.7 細(xì)胞球形成實(shí)驗(yàn) 將分選的細(xì)胞培養(yǎng)于超低黏附的96孔培養(yǎng)板中，每孔100個(gè)細(xì)胞，用200 μL/孔的Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)。每種細(xì)胞設(shè)10個(gè)復(fù)孔。以后每隔2天換液1次，換液時(shí)小心吸取每孔中上層培養(yǎng)液60 μL，然后再補(bǔ)加60 μL新鮮培養(yǎng)液。定期用倒置顯微鏡觀察各個(gè)孔中形成細(xì)胞球的情況并記錄照相。每大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)計(jì)數(shù)為1個(gè)細(xì)胞球。

1.8 統(tǒng)計(jì)處理 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 小細(xì)胞肺癌的原代培養(yǎng)和傳代建系 將1例來(lái)源于小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化為單個(gè)細(xì)胞后，在含有EGF和bFGF的Defined K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)至第3天，培養(yǎng)瓶中開(kāi)始出現(xiàn)典型貼壁生長(zhǎng)的上皮細(xì)胞。該培養(yǎng)體系能選擇性生長(zhǎng)腫瘤上皮細(xì)胞，幾乎沒(méi)有成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)（圖1）。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)的密度達(dá)到80%融合時(shí)，經(jīng)特殊的胰酶消化后細(xì)胞可成功傳代建立細(xì)胞系，將其命名為L(zhǎng)C004。該細(xì)胞系細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較快，在1∶10比例傳代的情況下，每4天即可傳代1次。到目前為止，該細(xì)胞系已穩(wěn)定傳代到25代以上。這個(gè)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的建立為以后肺癌干細(xì)胞的分離鑒定打下了良好的基礎(chǔ)。為了較好地反映原位肺癌細(xì)胞的功能，以下試驗(yàn)中所選用的細(xì)胞均為細(xì)胞系中第3、4代的細(xì)胞。

2.2 免疫組織化學(xué)鑒定培養(yǎng)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞 我們對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞用免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行了初步鑒定，結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)AE-1、CK-5、P53和CD44（圖2）?？紤]到我們從腫瘤組織中培養(yǎng)的細(xì)胞在1∶10比例傳代的情況下能穩(wěn)定傳代到25代以上，且培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)P53，這些細(xì)胞應(yīng)是小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。

圖2 建立的細(xì)胞系表達(dá)AE1（A）、CK5（B）、P53（C）和CD44（D）Fig.2 Established cell line expressed AE1(A), CK5(B), P53(C) and CD44(D)(×200)

2.3 小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中部分細(xì)胞高表達(dá)CD44 為了尋找可能的肺癌干細(xì)胞標(biāo)記，我們首先用CD44-FITC標(biāo)記腫瘤細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可被分為2群，其中一小群細(xì)胞（圖3的P3細(xì)胞群，約有5.1%）明顯高表達(dá)CD44（CD44++），從流式細(xì)胞學(xué)上分析這群細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，表現(xiàn)為所占細(xì)胞群的比例較低，細(xì)胞直徑較小，而主群細(xì)胞為CD44+的細(xì)胞（圖3的P2細(xì)胞群）。

圖3 CD44-FITC標(biāo)記后流式細(xì)胞分析小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系LC004Fig.3 Flow cytometry analysis of CD44-FITC stained small cell lung cancer cell line LC004

2.4 只有CD44++的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可形成完全克隆 將1個(gè)細(xì)胞接種于96孔板的1個(gè)孔中，經(jīng)過(guò)2周培養(yǎng)后觀察到CD44++細(xì)胞和CD44+細(xì)胞形成的克隆特性有明顯不同。CD44++可形成3種克隆，其中1種克隆的細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞體積較小，形成的克隆直徑較大，這樣的克隆為完全克?。╤oloclone）；與完全克隆相反，另一種克隆的細(xì)胞排列稀疏，細(xì)胞體積較大，形成的克隆直徑較小，這樣的克隆為流產(chǎn)克?。╬araclone）；介于兩者之間的克隆為部分克?。╩eroclone）（圖4）。文獻(xiàn)報(bào)道只有腫瘤干細(xì)胞可形成完全克?。?］。與CD44++細(xì)胞不同，CD44+細(xì)胞只能形成部分克隆和流產(chǎn)克隆。這些結(jié)果提示CD44++的肺癌細(xì)胞可能富集了腫瘤干細(xì)胞。

2.5 CD44++細(xì)胞具有較強(qiáng)的集落形成能力將250個(gè)分選的細(xì)胞接種到6孔板中的1個(gè)孔中，CD44++細(xì)胞形成的集落數(shù)為45.7±4.2，CD44+細(xì)胞形成的集落數(shù)為18.3±4.7，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。且CD44++細(xì)胞形成的集落直徑較大，細(xì)胞排列密集（圖5）。

圖4 CD44++肺癌細(xì)胞形成的3種克隆Fig.4 Three clones formed from CD44++ lung cancer cells(×100)

圖5 CD44++和CD44+細(xì)胞在6孔板中形成的集落Fig.5 Colonies formed from CD44++ and CD44+ cells in 6 well plates

2.6 細(xì)胞球形成試驗(yàn) 為了進(jìn)一步證實(shí)只有CD44++細(xì)胞中富集了腫瘤干細(xì)胞，我們進(jìn)行了細(xì)胞球形成試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)100個(gè)/孔的細(xì)胞，在超低黏附的96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)19 d后，7/10孔中的CD44++細(xì)胞可以增殖形成細(xì)胞球（圖6A），而CD44+細(xì)胞不能形成任何一個(gè)細(xì)胞球，且培養(yǎng)的過(guò)程中細(xì)胞逐漸死亡（圖6B）。

圖7 CD44-FITC和CD90-APC雙標(biāo)記小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后流式細(xì)胞分析的結(jié)果Fig.7 Flow cytometry analysis of small cell lung cancer cell line co-stained with CD44-FITC and CD90-APC

2.7 CD90可能是小細(xì)胞肺癌的干細(xì)胞標(biāo)記為了尋找更多的肺癌干細(xì)胞標(biāo)記，我們用CD44-FITC和CD90-APC共同標(biāo)記腫瘤細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞可被分為4群，分別為CD44+CD90-、CD44+CD90+、CD44++CD90-和CD44++CD90+，其中CD44++CD90+細(xì)胞所占比例為1.9%。為了檢測(cè)CD44++CD90+細(xì)胞是否富集了最多的肺癌干細(xì)胞，我們比較了CD44+（含CD44+CD90-及CD44+CD90+細(xì)胞，圖7的P2細(xì)胞群）、CD44++CD90-（圖7的P3細(xì)胞群）及CD44++CD90+（圖7的P4細(xì)胞群）細(xì)胞的細(xì)胞球形成能力。結(jié)果CD44+細(xì)胞仍不能形成任何細(xì)胞球，9/10的CD44++CD90+細(xì)胞孔中可形成細(xì)胞球，而只有1/10的CD44++CD90+細(xì)胞孔中可形成細(xì)胞球。這些結(jié)果提示CD44++CD90+富集了最多的腫瘤干細(xì)胞，CD44++CD90-群細(xì)胞中可能也含有少量的腫瘤干細(xì)胞，而CD44+CD90+和CD44+CD90-群細(xì)胞中沒(méi)有腫瘤干細(xì)胞。

3 討 論

關(guān)于腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定，目前常用的方法有直接從新鮮腫瘤組織中分離、從已有的穩(wěn)定建立的腫瘤細(xì)胞系中分離和從原代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中分離。從新鮮切除的腫瘤組織中直接分離的腫瘤干細(xì)胞能較真實(shí)地反映原位腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性，但由于新鮮切除的腫瘤組織中含有多種細(xì)胞成分，且多數(shù)分離到的腫瘤干細(xì)胞不能在體外培養(yǎng)，這些缺點(diǎn)使腫瘤干細(xì)胞的分離鑒定工作變得十分艱難，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究也很困難。從已有穩(wěn)定建立的腫瘤細(xì)胞系中分選腫瘤干細(xì)胞取材容易，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，但由于細(xì)胞系經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期體外或動(dòng)物體內(nèi)傳代，其中的腫瘤干細(xì)胞可能已發(fā)生很大變異，分離到的腫瘤干細(xì)胞不一定能真實(shí)反映原位腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)特性。而從原代培養(yǎng)或經(jīng)體外短期傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中分離的腫瘤干細(xì)胞可以解決上述兩種分離方法的局限性，但由于腫瘤細(xì)胞的原代培養(yǎng)十分困難，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。本研究中我們應(yīng)用一種特殊的無(wú)血清培養(yǎng)基，成功地從1例小細(xì)胞肺癌組織中培養(yǎng)出了純度很高的原代肺癌細(xì)胞，且細(xì)胞很容易傳代擴(kuò)增到25代以上。有文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞呈懸浮的細(xì)胞球生長(zhǎng)，且細(xì)胞一旦貼壁后腫瘤干細(xì)胞就會(huì)發(fā)生分化［7］。我們應(yīng)用Defined K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞均為典型的貼壁細(xì)胞，而我們的試驗(yàn)結(jié)果支持肺癌干細(xì)胞存在于這些貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞中。從試驗(yàn)操作的過(guò)程來(lái)看，從貼壁的細(xì)胞中分離腫瘤干細(xì)胞較從細(xì)胞球中分離腫瘤干細(xì)胞更容易可行。該細(xì)胞系的建立為我們后續(xù)的腫瘤干細(xì)胞分離鑒定工作打下了良好的基礎(chǔ)。

腫瘤干細(xì)胞和正常干細(xì)胞往往具有相同的干細(xì)胞標(biāo)記。CD44是間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記，也是多種腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記［8］，但CD44是否是肺癌的干細(xì)胞標(biāo)記尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究中我們首先用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了CD44在原代建立的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有的細(xì)胞都表達(dá)CD44，但其中約5.1%的細(xì)胞CD44明顯強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，且它們的直徑較小，符合腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)。為了驗(yàn)證CD44強(qiáng)陽(yáng)性的細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的特點(diǎn)，我們用流式細(xì)胞儀分選了CD44++和CD44+的細(xì)胞并研究它們的生物學(xué)特性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有CD44++細(xì)胞可以形成完全克隆，而CD44+細(xì)胞只能形成部分克隆和流產(chǎn)克隆。文獻(xiàn)報(bào)道只有腫瘤干細(xì)胞可以形成完全克隆，祖細(xì)胞可以形成部分克隆，而終末分化的細(xì)胞不能形成克隆或只能形成流產(chǎn)克隆［6］。這些結(jié)果提示小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞富集在CD44++的細(xì)胞群中。與單細(xì)胞克隆的結(jié)果相似，在平板集落形成試驗(yàn)中，CD44++形成的集落明顯多于CD44+細(xì)胞，且CD44++細(xì)胞形成的集落直徑較大，細(xì)胞排列緊密，說(shuō)明CD44++細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。在超低黏附的培養(yǎng)板上能形成細(xì)胞球是腫瘤干細(xì)胞的主要特點(diǎn)之一［9］。在我們的試驗(yàn)結(jié)果中，只有CD44++的細(xì)胞可以形成細(xì)胞球，而CD44+細(xì)胞不能形成細(xì)胞球，進(jìn)一步證明了肺癌干細(xì)胞富集在CD44++細(xì)胞中。

CD90是間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)記，也是肝癌干細(xì)胞的表面標(biāo)記［10］。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用CD44和CD90共同標(biāo)記小細(xì)胞肺癌細(xì)胞時(shí)，有1.9%的肺癌細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記為CD44++CD90+。為了驗(yàn)證肺癌干細(xì)胞是否富集在CD44++CD90+細(xì)胞中，我們重點(diǎn)比較了CD44++CD90+和CD44++CD90-細(xì)胞的細(xì)胞球形成能力，結(jié)果CD44++CD90+形成細(xì)胞球的能力是CD44++CD90-細(xì)胞的8倍，而CD44+CD90+和CD44+CD90-細(xì)胞均不能形成細(xì)胞球，這些結(jié)果提示肺癌干細(xì)胞主要在CD44++CD90+細(xì)胞群中。

本研究借助于我們建立的原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，首次證實(shí)小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞高表達(dá)CD44和CD90，并成功分離到了小細(xì)胞肺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，為下一步深入研究肺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性和尋找有效的肺癌治療方法打下了較好的基礎(chǔ)。

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