向軍儉 李丹，2 王宏 王盼盼 鄧寧

1.暨南大學生命科學技術學院抗體工程中心，廣東 廣州 510632；2.南方醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，廣東 廣州 510515

肺癌的發(fā)病率和死亡率在中國乃至世界許多國家居于首位，其高轉移率及對放化療藥物的耐藥是肺癌患者死亡的重要原因［1］。目前傳統(tǒng)的治療方法主要針對早期肺癌患者，對于晚期患者則療效不佳。因此近年來新的治療手段，尤其是靶向治療備受關注［2］。堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一種較強的促有絲分裂原，在多種腫瘤中表達升高，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展進程［3］。bFGF不僅可刺激腫瘤細胞的增殖，它作為一種重要的促血管新生因子，還可促進血管內皮細胞的增殖、黏附、遷移及新血管形成［4］。腫瘤的新生血管不僅為腫瘤組織的生長提供養(yǎng)分，更是腫瘤發(fā)生轉移的基礎［5］。因此本研究旨在通過建立Lewis肺癌轉移模型，以bFGF為靶點檢測抗bFGF抗體對肺癌生長，轉移及血管新生的抑制作用，為肺癌的治療提供一種新手段。

1 材料和方法

1.1 材料 人臍靜脈血管內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）由中山大學中山醫(yī)學院高國全教授饋贈。雌性C57 BL/6小鼠24只，6周齡，體質量（20±2）g，購自廣州南方醫(yī)科大學實驗動物中心。Lewis肺癌細胞株引自美國標準菌種收藏所（ATCC），由本室保存。bFGF單抗細胞株MabF7為本室制備、純化、保存。M199細胞培養(yǎng)基，SFM無血清培養(yǎng)基，低血清生長添加劑 （low serum growth supplement，LSGS）均購自Invitrogen公司。CCK-8試劑盒為日本同仁化學研究所產品。兔抗鼠/人CD31抗體（工作濃度為1∶1 000）及羊抗兔免疫組化試劑盒購自Santa Cruz公司。DAB顯色底物購自北京天根科技生化有限公司。

1.2 HUVECs增殖抑制試驗 取2～7代對數(shù)生長期的HUVECs細胞，調整細胞濃度至3×104個/mL，每孔100 μL接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)基換為含0.5%FBS，10 ng/mL bFGF的M199培養(yǎng)基，同時加入不同濃度的MabF7，對照組加入相同濃度的正常小鼠IgG，37 ℃培養(yǎng)3 d后，利用CCK-8試劑盒測定活細胞數(shù)量。

1.3 Lewis肺癌自發(fā)轉移模型的建立 取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞，采用0.25%胰酶消化，收集細胞并計數(shù)，將細胞濃度調整至2.5×106個/mL，于C57小鼠右前肢靠背部皮膚松軟處接種0.2 mL。待可觸及到腫瘤時，將小鼠隨機分為PBS組，bFGF單抗MabF7治療組（5 mg/mL），以及非免疫小鼠IgG陰性對照組（5 mg/mL），每組8只?？贵w采用瘤周皮下注射的方式給藥，每只小鼠注射0.2 mL，每3天注射1次，連續(xù)6次。

1.4 腫瘤生長曲線的繪制及肺轉移的評價利用游標卡尺測量荷瘤的長和寬，利用公式：V（mm3）=π×長×寬×寬×1000/6，計算瘤體積，并繪制曲線；同時測量小鼠體質量；給藥6次后眼球放血處死小鼠，取瘤、稱質量。抑瘤率=（1-給藥組平均瘤質量/PBS對照組平均瘤質量）×100%。完整取出雙肺并于解剖鏡下計數(shù)肺表面轉移瘤結節(jié)數(shù)。瘤組織及肺組織以中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋后切片，肺組織進行常規(guī)HE染色，光鏡下觀察。

1.5 瘤組織微血管密度計數(shù) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，3%雙氧水阻斷內源性過氧化物酶5 min；將切片放PH為6.0的檸檬酸緩沖液中，微波爐以中火修復6 min×4；封閉，37 ℃， 1 h；兔抗鼠/人CD31抗體做1∶1 000稀釋，4 ℃，過夜；后續(xù)步驟按試劑盒說明操作，DAB顯色，蘇木精復染，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。對于MVD的計數(shù)原則是：按Weidner報道的方法［6］，首先在低倍視野下（100倍）掃視整張石蠟切片，每張切片找出5個微血管密集區(qū)，然后在高倍視野下（400倍）計數(shù)。每張切片共計數(shù)5個視野。微血管的判斷標準為:⑴與鄰近的微血管、腫瘤細胞及其他結締組織成分不相連、標記清晰的內皮細胞及內皮細胞簇均可作為一個可計數(shù)的微血管。⑵可能源于同一微血管的內皮細胞，如染色清晰且相互分離，也可作為單獨的微血管計數(shù)。⑶血管腔及腔內紅細胞的存在不是確認微血管的必備條件。⑷對腫瘤區(qū)內的硬化區(qū)、腫瘤細胞稀疏區(qū)及鄰近良性組織區(qū)域內的血管不進行計數(shù)。

1.6 統(tǒng)計處理 采用SPSS 9.0軟件。組間差異采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 bFGF單抗MabF7對bFGF誘導的HUVECs增殖的影響 MabF7屬于IgG1亞類，不與aFGF發(fā)生交叉反應。MabF7可以劑量依賴的方式抑制bFGF誘導的HUVECs的增殖，IC50為50 μg/mL（圖1）。

2.2 bFGF單抗MabF7對Lewis肺癌生長的抑制 接種后第9天小鼠成瘤率為100%，小鼠隨機分為3組，并開始給藥。MabF7治療組腫瘤生長速度自第4次給藥開始較PBS組減慢，IgG對照組與PBS組相比，則差異無統(tǒng)計學意義（圖2A）。給藥6次后MabF7治療組瘤質量為（2.6±1.0）g，顯著低于PBS組的（5.1±1.3）g（P＜0.05），抑瘤率為48.23%。IgG對照組瘤質量為（4.7±0.4）g，與PBS組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），抑瘤率為8.43 %（圖2B）。

2.3 bFGF單抗MabF7對Lewis肺癌轉移的抑制 本小鼠模型中Lewis肺癌發(fā)生轉移的部位主要為肺，轉移率超過80%。給藥6次后處死小鼠，取完整肺組織于解剖鏡下計數(shù)肺表面轉移瘤結節(jié)數(shù)。并對雙肺進行HE染色，確定此結節(jié)為轉移的Lewis肺癌（圖3A）。bFGF單抗MabF7組與PBS組相比肺轉移瘤結節(jié)數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，表1），抑制率為75.59%。對照IgG組與PBS組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），抑制率為3.99%（表1）。

2.4 bFGF單抗MabF7對瘤組織MVD的影響以兔抗鼠/人CD31多抗為一抗，對腫瘤組織切片進行免疫組化染色，400倍顯微鏡下計數(shù)腫瘤組織實質區(qū)的MVD（圖3B），bFGF單抗MabF7組MVD為22.0±2.9，顯著低于PBS組的43.5±11.6（P＜0.05）；對照IgG組MVD為45.8±5.4，與PBS組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 bFGF單抗MabF7抑制bFGF誘導的HUVECs的增殖Fig.1 Inhibition of HUVECs proliferation by injecting MabF7

圖2 bFGF單抗MabF7對Lewis肺癌生長的抑制Fig.2 Inhibition of LLC tumor growth by injecting MabF7

圖3 bFGF單抗MabF7對Lewis肺癌轉移及腫瘤組織MVD的抑制Fig.3 Inhibition of LLC metastasis and MVD in tumor tissue by injecting MabF7

表1 bFGF單抗MabF7對Lewis肺癌轉移的抑制Tab.1 Inhibition of LLC metastasis by injecting MabF7

3 討 論

肺癌的高轉移率及對藥物的耐藥性是造成其高死亡率的重要原因。bFGF是成纖維生長因子家族中的一員，作為一種較強的有絲分裂原，在肺癌等多種腫瘤組織中高表達。有研究表明50%以上的非小細胞肺癌患者組織出現(xiàn)bFGF表達升高，且與淋巴結轉移及分期相關，其在伴有淋巴結轉移及中晚期肺癌組織中的表達明顯高于早期［7-8］。大多數(shù)學者認為患者血清中bFGF的水平可作為肺癌早期診斷及預后的標志［9］。另外多種體外研究也證實bFGF不僅促進肺癌細胞的增殖，還是肺癌細胞對化療耐藥的重要原因之一。bFGF與腫瘤細胞的表面高親和力受體FGFRs結合，使后者通過二聚化而活化，活化的受體可激活下游MEK、PKC、PI3K等信號通路，從而促進細胞的增殖及逃避凋亡［10-11］。因此bFGF可能成為肺癌治療的良好靶點。很多研究也表明抑制bFGF及其受體的表達可顯著地抑制肺癌的生長［12］。

近年來隨著生物學及醫(yī)藥技術的發(fā)展，抗體藥物因其靶向性好、特異性高、療效好、毒性低而成為現(xiàn)代生物制藥的核心。bFGF抗體也被許多學者用于不同腫瘤治療的研究［13-14］。MabF7是本室以人重組bFGF免疫小鼠，通過傳統(tǒng)雜交瘤技術獲得的能夠阻斷bFGF生物學活性的單克隆抗體，前期工作顯示此單抗可在體內外抑制黑色素瘤細胞的生長，并能提高黑色素瘤對化療藥物的敏感性［15-16］。本研究首先通過血管內皮細胞增殖抑制實驗證實MabF7可抑制外源性bFGF，刺激HUVECs增殖的活性，證明MabF7為特異性針對bFGF的中和性單抗。接下來以Lewis肺癌細胞建立C57 BL/6小鼠自發(fā)性肺癌轉移模型。Lewis肺癌可高表達bFGF，并且bFGF的表達量與沙利度胺、魟魚軟骨多糖等藥物抑制肺癌生長及轉移密切相關［17-18］。本研究以此為模型發(fā)現(xiàn)bFGF單抗MabF7可顯著抑制腫瘤的生長及向肺組織的轉移。

腫瘤的增殖、轉移及耐藥性的產生都依賴于腫瘤血管新生。血管新生過程包括細胞外基質的降解，內皮細胞遷移、黏附、內皮細胞增殖、管腔的形成、細胞基質的沉積和血管成熟等過程。此過程由一系列的促血管新生因子及抗血管新生因子所調控，其中bFGF和VEGF就是重要的促血管新生因子［4-5］。bFGF不僅可促進血管內皮細胞的增殖，還可調節(jié)細胞外基質和基質金屬蛋白酶MMPs的表達，從而影響血管內皮細胞的黏附遷移及成管過程。除此之外bFGF還與VEGF、PDGF等細胞因子相互協(xié)同，組成血管新生的調節(jié)網(wǎng)絡［19-20］。腫瘤內的新生血管由于其較低的成熟度和較高的滲透性，成為腫瘤細胞向其他器官發(fā)生轉移的物質基礎，因此抑制腫瘤血管新生的過程可有效地阻止腫瘤轉移。本研究發(fā)現(xiàn)bFGF單抗MabF7可顯著地抑制Lewis肺癌組織的微血管密度，這可能是MabF7有效抑制肺癌轉移的主要原因之一。

綜上所述，bFGF單抗可通過控制肺癌細胞的增殖及血管新生等途徑對Lewis肺癌的生長及轉移起到抑制作用。其具體的作用機制及與化療藥物的聯(lián)合作用還需進一步研究。

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