張麗麗 胡 堯 侯永清 丁斌鷹 王 蕾 劉玉蘭 朱惠玲

現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)中，細(xì)菌、病毒、飼養(yǎng)管理以及環(huán)境因素等各方面的刺激，使仔豬的免疫系統(tǒng)長(zhǎng)期處于高度激活狀態(tài)，影響了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在仔豬體內(nèi)的分配，造成仔豬生長(zhǎng)受阻，生產(chǎn)性能下降。脯氨酸（proline，PRO）在健康成年哺乳動(dòng)物中，可以通過(guò)精氨酸酶途徑由精氨酸合成，也可以通過(guò)吡咯啉-5-羧酸鹽（P5C）合成途徑由谷氨酸酯和谷氨酸鹽合成。然而，這些合成途徑在禽類和幼畜中非常有限。PRO占膠原蛋白質(zhì)中氨基酸的1/3，對(duì)于骨骼的發(fā)育有著極其重要的作用。臨床證明，日糧中添加PRO可以加快動(dòng)物及人類手術(shù)后的傷口復(fù)合。近幾年的研究結(jié)果表明，功能性氨基酸能增強(qiáng)斷奶仔豬的腸道免疫屏障和抗氧化能力，從而促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)發(fā)育。Ronald O.Ball等指出，PRO可能是仔豬腸道受損時(shí)必需的氨基酸。當(dāng)前有關(guān)PRO在仔豬日糧中的應(yīng)用研究還很少，因此我們假設(shè)脯氨酸在仔豬日糧中——特別是腸道受損時(shí)有明顯應(yīng)用效果。本試驗(yàn)用大腸桿菌脂多糖（LPS）多次刺激斷奶仔豬建立免疫應(yīng)激及腸道受損模型，通過(guò)觀測(cè)PRO對(duì)LPS刺激仔豬生長(zhǎng)性能和血液生化指標(biāo)的影響，探索PRO在仔豬日糧中的應(yīng)用效果，為PRO應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

L-脯氨酸（PRO），純度≥99.6%，L-丙氨酸（ALA），純度≥99.7%，兩種均為市售藥用級(jí)產(chǎn)品。大腸桿菌脂多糖（LPS）：大腸桿菌血清型055:B5，SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取來(lái)源一致，(22±2)日齡斷奶仔豬[杜洛克×長(zhǎng)白×大白，體重(9.13±0.85)kg]36 頭，采用 2×3因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)。設(shè)免疫應(yīng)激和PRO添加量2個(gè)因子，其中免疫應(yīng)激設(shè)2個(gè)水平：無(wú)應(yīng)激（不注射LPS，注射等劑量的生理鹽水）和LPS應(yīng)激（腹膜注射100 μg/kgBW LPS）；PRO添加量設(shè)3個(gè)水平：0、0.5%和1.0%。共6個(gè)處理組，分別為：①無(wú)應(yīng)激，0%PRO，②LPS應(yīng)激，0%PRO，③無(wú)應(yīng)激，0.5%PRO，④LPS應(yīng)激，0.5%PRO，⑤無(wú)應(yīng)激，1%PRO，⑥LPS應(yīng)激，1%PRO。每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)1頭仔豬。各處理組的基礎(chǔ)日糧營(yíng)養(yǎng)水平一致，為了平衡各組的含氮量，①、②組添加與1%PRO等氮的丙氨酸，③、④組另添加與0.5%PRO等氮的丙氨酸。試驗(yàn)期共20 d，試驗(yàn)前10 d，未進(jìn)行LPS刺激處理，分別于試驗(yàn)第10、13、20 d對(duì)LPS應(yīng)激處理組（②、④、⑥組）仔豬按100 μg/kgBW劑量腹膜注射LPS，無(wú)應(yīng)激處理組（①、③、⑤組）仔豬腹膜注射相應(yīng)劑量的滅菌生理鹽水。于試驗(yàn)第10、20 d空腹稱重，前腔靜脈采血，分離血漿，測(cè)定血液生化指標(biāo)。

1.3 飼養(yǎng)管理

仔豬預(yù)飼3 d后進(jìn)行正式試驗(yàn)。豬舍為全封閉式，屋頂以排氣扇通風(fēng)，試驗(yàn)期間豬舍保持溫度為22～25℃。試驗(yàn)豬在代謝籠中單體飼養(yǎng)，自由采食，乳頭式飲水器飲水，定時(shí)清掃和消毒豬舍。

1.4 日糧組成

基礎(chǔ)日糧配制參照NRC（1998）豬的營(yíng)養(yǎng)需要（8～20 kg），其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

詳細(xì)記錄每天的采食量，分別于試驗(yàn)的第10、20 d清晨空腹稱重（禁食12 h，禁水1 h后），計(jì)算試驗(yàn)豬在10～20 d的平均日采食量（ADFI）、平均日增重（ADG）以及料重比（F/G）。

1.5.2 血液生化指標(biāo)的測(cè)定

分別于試驗(yàn)第10、20 d注射LPS或生理鹽水3 h后前腔靜脈無(wú)菌采血，用10 ml肝素抗凝管收集，靜置15 min后以3 000 r/min離心10 min，取上清液。測(cè)定以下血液指標(biāo)：

尿素氮（BUN），酶偶聯(lián)速率法測(cè)定。過(guò)氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD），均采用試劑盒測(cè)定，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件GLM模型下的多因素方差分析以及Duncan's法多重比較，以P＜0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 日糧中添加脯氨酸對(duì)LPS刺激仔豬生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表2）

由表2可知，在試驗(yàn)的10～20 d，LPS刺激導(dǎo)致仔豬的采食量比非LPS刺激組下降14.07%（P＜0.05），日糧中添加0.5%和1.0%的PRO對(duì)采食量沒(méi)有影響（P＞0.05）；LPS應(yīng)激導(dǎo)致仔豬的平均日增重比非應(yīng)激組降低12.18%（P＜0.05），日糧添加PRO對(duì)仔豬日增重沒(méi)有影響（P＞0.05）；在料重比方面，各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 脯氨酸對(duì)LPS刺激仔豬血液生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表3、表4）

LPS首次應(yīng)激時(shí)（第10 d）：由表3和表4可知，LPS刺激提高了血漿BUN（3.71 vs 4.03，+8.72%）（P=0.05），對(duì)血漿 CAT、MDA 和 SOD 均無(wú)影響（P＞0.05）；PRO 降低了血漿 BUN（4.15 vs 3.73，－10.1%）（P＜0.05），與0%PRO組相比，0.5%PRO組血漿BUN降低了 20.18%（P＜0.05），1%PRO 組差異不顯著（P＞0.05），0.5%和1%PRO 組差異顯著（P＜0.05）。PRO 降低了 MDA（9.16 vs 8.19，－10.59%）（P＜0.05），另外，PRO對(duì)血液中的MDA的影響與LPS刺激存在互作效應(yīng)，即對(duì)注射生理鹽水的仔豬，與0%PRO組相比，0.5%PRO 組血漿 MDA 差異不顯著（P＞0.05），1%PRO組降低了47.19%（P＜0.05），而對(duì)于LPS注射仔豬，三組差異均不顯著（P＞0.05）。PRO提高了SOD（138.40 vs 160.55，+16.0%）（P＜0.05），與 0%PRO 組相比，0.5%和1%PRO組的SOD分別提高了8.64%和16.87%（P＜0.05），0.5%和 1%PRO 組差異不顯著（P＞0.05）。PRO 對(duì)血漿 CAT無(wú)影響（P＞0.05）。

仔豬經(jīng)3次LPS刺激后（第20 d）：由表3和表4可知，LPS刺激對(duì)血漿中BUN、CAT、MDA和SOD均無(wú)影響；PRO提高了SOD（148.32 vs 155.69，+4.97%）（P＜0.05），與0%PRO組相比，0.5%PRO組的SOD 提高了 6.63%（P＜0.05），1%PRO 組差異不顯著 （P＞0.05）。PRO對(duì)血漿CAT和MDA無(wú)影響（P＞0.05）。

表2 日糧添加脯氨酸對(duì)LPS刺激仔豬生長(zhǎng)性能的影響（10～20 d）

表3 日糧中添加脯氨酸對(duì)LPS刺激仔豬血液生化指標(biāo)的影響

表4 不同水平的脯氨酸添加量對(duì)仔豬血液生化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 日糧添加脯氨酸對(duì)LPS應(yīng)激仔豬生長(zhǎng)性能的影響

LPS是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，能誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生急性細(xì)菌感染癥狀，如厭食、嗜睡和發(fā)熱等，導(dǎo)致動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低。本試驗(yàn)中，LPS刺激導(dǎo)致仔豬的日增重和日采食量顯著降低，并出現(xiàn)厭食、嘔吐、嗜睡和發(fā)熱等癥狀，這與劉玉蘭等的研究結(jié)果一致。在本試驗(yàn)的10～20 d期間，仔豬受到LPS刺激后，應(yīng)激組的生長(zhǎng)性能顯著降低，日糧中添加不同水平PRO對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的降低沒(méi)有緩解作用，可能由于基礎(chǔ)日糧中PRO水平較高，可以滿足應(yīng)激的需要。

3.2 日糧添加脯氨酸對(duì)LPS刺激仔豬血液生化指標(biāo)的影響

血漿BUN約占機(jī)體非蛋白氮的一半左右，BUN含量高低反映蛋白質(zhì)分解代謝速率的變化。BUN濃度的降低表明氮（蛋白質(zhì)）的體內(nèi)沉積增加，氨基酸平衡良好，飼料中蛋白質(zhì)利用率提高。本試驗(yàn)結(jié)果表明PRO顯著降低LPS首次應(yīng)激后血漿BUN，日糧添加0.5%和1%PRO均能提高血漿BUN，且兩組差異不顯著，說(shuō)明日糧中添加0.5%的PRO已經(jīng)滿足仔豬需要。可能的原因是：LPS刺激后，炎性因子分泌增加，導(dǎo)致肌肉蛋白質(zhì)分解加強(qiáng)，使血漿BUN濃度升高，添加0.5%的脯氨酸促進(jìn)了氮素的重新利用，從而降低了血漿BUN濃度。

動(dòng)物機(jī)體內(nèi)抗氧化能力與健康存在著密切關(guān)系，自由基理論認(rèn)為，生物體內(nèi)存在自由基的清除系統(tǒng)，抗氧化酶系統(tǒng)是其中的一種，它包括CAT和SOD等。它們能有效阻止生物膜發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)，防止發(fā)生膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用，從而保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化劑的傷害，其活力的高低可間接反映機(jī)體清除自由基能力的強(qiáng)弱，正常生理?xiàng)l件下自由基的產(chǎn)生與清除處于動(dòng)態(tài)平衡。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的一種重要分解產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)，核酸及腦磷脂等含氨基化合物反應(yīng)，使之發(fā)生交聯(lián)，喪失功能。MDA作為生物體內(nèi)自由基的指示物，廣泛地作為各種氧自由基損傷機(jī)體的指標(biāo)[8]。本試驗(yàn)中，日糧中添加PRO顯著提高了血漿SOD活性，降低了MDA，說(shuō)明日糧中添加PRO可提高機(jī)體清除氧自由基的能力，從而改善仔豬機(jī)體抗氧化能力?？赡苁且?yàn)镻RO通過(guò)生成精氨酸進(jìn)一步生成氮，清除過(guò)多自由基。Wu（1997）研究結(jié)果指出，脯氨酸是合成瓜氨酸和精氨酸的重要來(lái)源。有研究表明日糧中添加精氨酸可維持腸道黏膜的抗氧化和過(guò)氧化的平衡，清除過(guò)多的自由基。

4 結(jié)論

在本次試驗(yàn)條件下，LPS刺激顯著降低了仔豬的生長(zhǎng)性能，提高了血漿中尿素氮水平，日糧添加0.5%的PRO可提高機(jī)體抗氧化能力和降低血漿中尿素氮水平；添加脯氨酸對(duì)LPS刺激導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制沒(méi)有緩解作用。

若干篇，刊略，需者可函索）