張景云，白雅梅，于 萌，李文霞，呂文河*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

馬鈴薯作為世界上主要糧食作物之一，其產(chǎn)量?jī)H排在小麥、玉米和水稻之后，占第四位。由于馬鈴薯是對(duì)鹽比較敏感的一種作物[1]，所以鹽脅迫嚴(yán)重影響了馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響了馬鈴薯的生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)許多研究者在馬鈴薯耐鹽性[1-4]、馬鈴薯脫毒苗生物產(chǎn)量及VC含量的變化[5]、耐鹽相關(guān)生理指標(biāo)的變化[6]及國(guó)外許多研究者在馬鈴薯耐鹽方面做了較多的研究[7-10]，但從未見(jiàn)過(guò)有關(guān)鹽脅迫對(duì)二倍體馬鈴薯細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道。由于二倍體馬鈴薯中具有大量的抗性基因及優(yōu)良品質(zhì)性狀基因[11-13]，因此從細(xì)胞水平上研究二倍體馬鈴薯的耐鹽性具有非常重要的意義。本試驗(yàn)選取經(jīng)12次輪回選擇適應(yīng)長(zhǎng)日照的富利亞（Solanum phureja，PHU）與窄刀薯（S.stenotomum，STN）雜種（PHUSTN）無(wú)性系試管苗為材料，研究耐鹽無(wú)性系和鹽敏感無(wú)性系受鹽脅迫后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上的差異，尋找耐鹽性鑒定的指標(biāo)，為篩選和培育馬鈴薯耐鹽品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究對(duì)45份二倍體馬鈴薯（PHU-STN）無(wú)性系試管苗進(jìn)行了耐鹽性篩選，篩選出耐鹽和鹽敏感的無(wú)性系，選取了其中耐鹽性較強(qiáng)的無(wú)性系BD54-8和耐鹽性較弱的無(wú)性系BD57-3為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 基礎(chǔ)苗培養(yǎng)

2009年11月培養(yǎng)基礎(chǔ)苗，取馬鈴薯脫毒試管苗，將其切成帶1片葉的小莖段，插入裝有MS培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，將其置于溫度（25±2）℃，光照2 000～3 000 lx，每日光照16 h的條件下培養(yǎng)。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)基的配制：配制含有NaCl濃度為0、30 mmol·L-1的 MS培養(yǎng)基，pH 5.8，121℃滅菌 15 min。

材料的培養(yǎng)：取20 d苗齡的試管苗，單一節(jié)莖段培養(yǎng)，取中間莖段，長(zhǎng)約1 cm，帶有一個(gè)葉，每瓶插10個(gè)莖段，20 d后取材固定。

1.2.3 電鏡樣品的制備與觀察

將所取葉片切成1 mm×3 mm的長(zhǎng)方形，放入2.5%、pH 6.7的戊二醛中，于4℃固定24 h以上→pH 7.2磷酸緩沖液沖洗3次→2%四氧化餓固定1.5 h→pH 7.2磷酸緩沖液沖洗3次→酒精逐級(jí)脫水→100%乙醇與丙酮置換→環(huán)氧樹(shù)脂812滲透、包埋→置于恒溫箱內(nèi)聚合→ULPRACUT-EXINXIN型超薄切片機(jī)切片→醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛溶液25℃染色，H-7650型透射電子顯微鏡觀察、拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下細(xì)胞膜的變化

正常情況下被測(cè)的兩個(gè)無(wú)性系的細(xì)胞膜清晰可見(jiàn)（見(jiàn)圖1A、3A）。鹽分脅迫下，BD57-3（見(jiàn)圖4A）膜的結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜部分向內(nèi)波折折疊，而耐鹽無(wú)性系BD54-8（見(jiàn)圖2B）的細(xì)胞膜沒(méi)有出現(xiàn)這種現(xiàn)象，說(shuō)明鹽敏感無(wú)性系BD57-3的細(xì)胞膜破壞比較嚴(yán)重。

2.2 鹽脅迫下葉綠體結(jié)構(gòu)的變化

耐鹽無(wú)性系BD54-8和鹽敏感無(wú)性系BD57-3在未經(jīng)NaCl脅迫時(shí)，葉綠體具有雙層膜，類囊體腔小且扁平，葉綠體緊貼在細(xì)胞邊緣，呈長(zhǎng)橢圓形，結(jié)構(gòu)規(guī)則?；ｉg有基質(zhì)片層相連，片層排列緊密（見(jiàn)圖1B、圖3B）。

耐鹽無(wú)性系BD54-8在30 mmol·L-1NaCl脅迫20 d后，葉綠體外形仍為長(zhǎng)橢圓形，葉綠體中的基粒片質(zhì)和基質(zhì)片層幾乎沒(méi)有受到影響，片層扭曲不明顯，葉綠體有空化的現(xiàn)象（見(jiàn)圖2A）。

鹽敏感無(wú)性系BD57-3在30 mmol·L-1NaCl脅迫20 d后，葉綠體結(jié)構(gòu)受到了損傷，幾乎縮成球形，邊緣膜模糊，內(nèi)部出現(xiàn)大而多的空化現(xiàn)象（見(jiàn)圖4A），片層結(jié)構(gòu)扭曲嚴(yán)重，基粒的類囊體片層數(shù)減少或解體，只能見(jiàn)到一些松散的片層結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖4B）。

2.3 鹽脅迫下線粒體結(jié)構(gòu)的變化

耐鹽無(wú)性系BD54-8和鹽敏感無(wú)性系BD57-3在未經(jīng)NaCl脅迫時(shí)，線粒體的內(nèi)、外膜及嵴清晰可見(jiàn)，圍繞在葉綠體周圍（見(jiàn)圖1A、圖3A）。

耐鹽無(wú)性系BD54-8在NaCl脅迫20 d后，線粒體的內(nèi)、外膜及嵴仍清晰可見(jiàn)，嵴部分模糊不清（見(jiàn)圖2A、圖2B）。

鹽敏感無(wú)性系BD57-3在30 mmol·L-1NaCl脅迫20 d后，其線粒體內(nèi)、外膜膨脹，難以辨認(rèn)出內(nèi)、外膜之間的界限。線粒體基質(zhì)有些著色深，有些不著色，線粒體嵴均減少或者不明顯，且發(fā)育較差（見(jiàn)圖4A）。

圖1 耐鹽無(wú)性系BD54-8未經(jīng)鹽脅迫時(shí)質(zhì)膜、葉綠體、基粒、線粒體的結(jié)構(gòu)Fig.1 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt tolerant clone BD54-8 without salt stress

圖2 耐鹽無(wú)性系BD54-8經(jīng)30 mmol·L-1NaCl鹽脅迫后質(zhì)膜、葉綠體、基粒、線粒體的結(jié)構(gòu)Fig.2 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt tolerant clone BD54-8 with stressed at 30 mmol·L-1NaCl

圖3 鹽敏感無(wú)性系BD57-3未經(jīng)鹽脅迫時(shí)質(zhì)膜、葉綠體、基粒、線粒體的結(jié)構(gòu)Fig.3 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt sensitive clone BD57-3 without salt stress

圖4 鹽敏感無(wú)性系BD57-3經(jīng)30 mmol·L-1NaCl鹽脅迫后的質(zhì)膜、葉綠體、基粒、線粒體的結(jié)構(gòu)Fig.4 Ultrastructure of plasma membrane,chloroplast,granum and mitochondria of the salt sensitive clone BD57-3 with stressed at 30 mmol·L-1NaCl

3 討論與結(jié)論

鹽脅迫下植物細(xì)胞膜系統(tǒng)受到破壞，特別是將引起葉綠體、線粒體超微結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化[14]。鹽脅迫引起細(xì)胞器和膜結(jié)構(gòu)破壞，其破壞程度決定了植物耐鹽性的強(qiáng)弱，也是植物受到鹽害的一個(gè)重要特征。耐鹽性強(qiáng)的材料，細(xì)胞膜系統(tǒng)及細(xì)胞器的穩(wěn)定性高，受到的破壞程度小。本試驗(yàn)結(jié)果表明，耐鹽性強(qiáng)的無(wú)性系BD54-8細(xì)胞膜破壞程度小于鹽敏感無(wú)性系BD57-3，這與劉愛(ài)峰等對(duì)大麥的研究結(jié)果相一致[15]，由于耐鹽材料的細(xì)胞膜比較穩(wěn)定，能夠抵御鹽脅迫對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，對(duì)鹽脅迫表現(xiàn)出一定的忍耐力；鹽敏感材料的細(xì)胞膜容易被破壞，從而功能喪失。葉綠體是感受鹽脅迫最敏感的細(xì)胞器，正常情況下，葉綠體的內(nèi)、外兩層膜清晰可見(jiàn)，類囊體平行排列，基粒和基質(zhì)片層排列規(guī)則有序。鹽脅迫后，膜變得模糊，類囊體腫脹膨大，基粒和基質(zhì)片層模糊。有學(xué)者對(duì)甘薯、馬鈴薯在鹽脅迫下葉綠體的變化做了研究[10,16]。Smith等對(duì)不同耐鹽生態(tài)型的匍莖翦股穎（Agrostis stolonifera）做了研究[17]，結(jié)果表明，不同耐鹽生態(tài)型對(duì)NaCl的反應(yīng)各不相同，鹽脅迫破壞了鹽敏感型細(xì)胞的線粒體結(jié)構(gòu)，嵴的數(shù)目減少，線粒體膨脹，而耐鹽生態(tài)型結(jié)構(gòu)仍正常；水分脅迫下的玉米、鹽脅迫下的小麥耐鹽系愈傷組織和疫霉根腐病菌毒素對(duì)大豆根部的線粒體也表現(xiàn)出上述類似的結(jié)果[18-20]。因此，鹽分脅迫對(duì)線粒體超微結(jié)構(gòu)的影響，通常因植物耐鹽性的不同而不同。

本試驗(yàn)從研究鹽脅迫下細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)出發(fā)，尋找衡量二倍體馬鈴薯耐鹽性的強(qiáng)弱細(xì)胞學(xué)指標(biāo)，結(jié)果表明，細(xì)胞膜、葉綠體和線粒體都可以作為衡量二倍體馬鈴薯耐鹽性強(qiáng)弱的細(xì)胞學(xué)指標(biāo)。

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