李科，劉健，任紅英，蔣鑫

腦卒中是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)急癥之一，以高病死率、高致殘率為主要特點(diǎn)，搶救生命與腦功能的保護(hù)是治療重點(diǎn)，可是到目前為止，治療這類(lèi)患者的手段還是乏善可陳。近幾年，隨著對(duì)腦卒中病理生理研究的進(jìn)展，人們研究的焦點(diǎn)逐漸集中于如何減少腦卒中患者繼發(fā)炎癥反應(yīng)致腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡。白細(xì)胞介素-10（IL-10）是目前研究較多的一種抗炎因子，目前認(rèn)為 IL-10 能通過(guò)抑制腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和其他前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生減輕缺血后腦損傷，有利于神經(jīng)元的修復(fù)和存活，在腦缺血中有神經(jīng)保護(hù)作用[1]。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

36 只 6～8 周成年 SD 雄鼠，清潔級(jí)，體重200～250 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由嶺南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔抗大鼠 p53AIP1 抗體為英國(guó) Abcam 公司產(chǎn)品；羊抗兔 HRG 標(biāo)記二抗為美國(guó) SANTA Crus公司產(chǎn)品；重組大鼠白細(xì)胞介素-10（rrIL-10）為英國(guó) Peprotech EC 公司產(chǎn)品；總蛋白提取試劑盒為北京普利萊公司產(chǎn)品；Tunel 法凋亡檢測(cè)試劑盒為美國(guó)默克公司產(chǎn)品（目錄號(hào)：QIA39）；SDS-PAGE膠配制試劑盒為北京碧云天公司產(chǎn)品；HRP 標(biāo)記的GAPDH 內(nèi)參抗體為上海康成生物工程有限公司產(chǎn)品；26 號(hào)尼龍線栓為北京沙東生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；濃縮多聚賴氨酸為廣州威佳公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦梗死再灌注模型的構(gòu)建 36 只大鼠隨機(jī)抽取 6 只作為假手術(shù)組，其余 30 只為手術(shù)組。大鼠禁食 12 h 與禁水 6 h 后，氯胺酮100 mg/kg 大鼠肌肉注射麻醉。采用改良 MCAO（middle cerebral artery occlusion）法[2]，將預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸浸漬，60 ℃ 烘干處理過(guò)的直徑為 0.26 mm的線栓經(jīng)大鼠右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈（carotid artery，CA）置入約 18～22 mm（根據(jù)動(dòng)物大小調(diào)整插入線栓的深度），阻塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈，記錄梗阻開(kāi)始時(shí)間，固定外端的線栓并標(biāo)記留在皮膚外面線栓的長(zhǎng)度，縫合皮膚。大鼠麻醉未蘇醒時(shí)注意保暖。缺血 2 h后，拔出線栓約 10 mm，使線栓退至頸總動(dòng)脈杈處，實(shí)現(xiàn)腦缺血再灌注。

1.2.2 動(dòng)物模型評(píng)分 動(dòng)物模型評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（Zea longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)）[2]如下：

0 分：無(wú)神經(jīng)缺損癥狀，活動(dòng)正常；

1 分：不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢（輕度局灶性神經(jīng)功能缺損）；

2 分：行走時(shí)身體向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈（中度局灶性神經(jīng)功能缺損）；

3 分：行走時(shí)向偏癱側(cè)傾倒（重度局灶性神經(jīng)功能缺損）；

4 分：不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。

評(píng)分 1～3 分即符合本實(shí)驗(yàn)要求，否則另選大鼠再行手術(shù)補(bǔ)足手術(shù)組，符合要求的大鼠隨機(jī)分為2組，一組經(jīng)尾靜脈給予 rrIL-10（稱為 IL-10組），按照藥物/大鼠 = 10 mg/kg 的比例經(jīng)鼠尾靜脈泵入濃度 20 mg/L 的 IL-10，速度為 15 μg/h；另 1組不做任何干預(yù)，為對(duì)照組。假手術(shù)組：除不插線栓外，其余操作與對(duì)照組相同。

1.2.3 大鼠分組 各組內(nèi)大鼠分別按照術(shù)后 24、48 和72 h 隨機(jī)分為 3 個(gè)亞組，于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，快速斷頭取右側(cè)大腦；沿視交叉處冠狀切開(kāi)，向枕部方向切取約 2 mm 厚腦組織，液氮快速冷凍，–70 ℃ 冷藏備用。

1.2.3.1 石蠟切片與 HE 染色 樣本常規(guī)中性甲醛固定過(guò)夜-梯度酒精、二甲苯脫水-浸蠟-包埋-切片（厚度3 μm）-HE染色-光鏡觀察。

1.2.3.2 冰凍切片與 Tunel 染色 樣本規(guī)冰凍切片機(jī)切片，厚度 5 μm 冰凍切片應(yīng)用 Tunel 染色試劑盒染色，程序嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行；防熒光淬滅封片，熒光顯微鏡（485/535 nm）觀察。

1.2.4 p53AIP1 蛋白表達(dá)的測(cè)定

1.2.4.1 蛋白樣品制備 蛋白提取采用北京普利來(lái)公司的總蛋白試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。每100 mg 腦組織提取的總蛋白溶解在 1 ml 2.5%SDS 溶液中備用。

1.2.4.2 SDS-PAGE 電泳 北京普利來(lái)公司生產(chǎn)的配膠試劑盒 12% 分離膠、5% 濃縮膠，100 V 恒壓電泳 2 h，170 mA 恒流濕式電轉(zhuǎn) PVDF 膜 2 h；1xTBST 洗膜 3 次；5% 脫脂奶粉溶液封閉 2 h，1∶1000 一抗孵育 4 ℃ 過(guò)夜，1xTBST 洗膜 3 次；1∶2000 二抗孵育 2 h，1xTBST 洗膜 3 次；北京普利來(lái)公司電致化學(xué)（ECL）發(fā)光液發(fā)光處理，X 線曝光檢查蛋白條帶；GAPDH 內(nèi)參實(shí)驗(yàn)過(guò)程同上。

凝膠成像結(jié)果使用 Gelpro Analyzer 4 軟件分析蛋白條帶光密度值，數(shù)據(jù)引入 EXCEL。數(shù)據(jù)采用 SPSS13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所得數(shù)據(jù)采用的比較采用單因素定量資料的方差

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分析。方差齊，組間多重比較采用 LSD 分析，方差不齊，組間多重比較采用 Dunnett’s T3 分析；以P ＜ 0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多個(gè)總體均數(shù)的兩兩比較采用 q 檢驗(yàn)，以 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動(dòng)物模型評(píng)分情況（見(jiàn)表 1）

表1 各組動(dòng)物評(píng)分結(jié)果Table 1 Score results in each group

2.2 石蠟切片、HE 染色

觀察可見(jiàn)對(duì)照組梗死區(qū)細(xì)胞稀少，廣泛的神經(jīng)元壞死，細(xì)胞溶解伴軟化灶形成；細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞體縮小變形，染色加深，核消失，血管可見(jiàn)粒細(xì)胞附壁及浸潤(rùn)；細(xì)胞及組織間隙水腫，梗死灶周?chē)梢?jiàn)“氣球樣改變”和間質(zhì)水腫，水腫以皮層下結(jié)構(gòu)及梗死區(qū)向非梗死區(qū)的移行區(qū)為重。IL-10組相對(duì)較輕。假手術(shù)組則無(wú)上述病理改變（圖 1）。

2.3 冰凍切片、Tunel 染色

Tunel 免疫熒光顯微鏡不同波長(zhǎng)（485/535 nm）觀察也可見(jiàn)到無(wú)論哪個(gè)時(shí)間段，IL-10組細(xì)胞凋亡情況均較對(duì)照組輕；假手術(shù)組極少見(jiàn)凋亡細(xì)胞（圖 2）。

2.4 p53AIP1 蛋白表達(dá)情況

圖1 各組大鼠不同處死時(shí)間的石蠟切片 HE 染色結(jié)果（A：假手術(shù)組 24 h；B：對(duì)照組 24 h；C：白細(xì)胞介素-10組 24 h；D：假手術(shù)組 48 h；E：對(duì)照組 48 h；F：白細(xì)胞介素-10組 48 h；G：假手術(shù)組 72 h；H：對(duì)照組 72 h；I：白細(xì)胞介素-1072 h）Figure 1 The HE staining of paraffin section at all time piont of treatment groups.A: Sham group after 24 h; B: Control group after 24 h; C: IL-10 group after 24 h; D: Sham group after 48 h; E: Control group after 48 h; F: IL-10 group after 48 h; G: Sham group after 72 h; H: Control group after 72 h; I: IL-10 group after 72 h.

圖2 各組大鼠不同處死時(shí)間的 Tunel 染色冰凍切片免疫熒光（485/535 nm）（A：假手術(shù)組 24 h；B：對(duì)照組 24 h；C：白細(xì)胞介素-10組 24 h；D：假手術(shù)組 48 h；E：對(duì)照組 48 h；F：白細(xì)胞介素-10組 48 h；G：假手術(shù)組 72 h；H：對(duì)照組 72 h；I：白細(xì)胞介素-1072 h）Figure 2 The Tunel staining of frozen sections with immunofluorescence at all time piont of treatment groups.A: Sham group after 24 h; B: Control group after 24 h; C: IL-10 group after 24 h; D: Sham group after 48 h; E: Control group after 48 h; F: IL-10 group after 48 h; G: Sham group after 72 h; H: Control group after 72 h; I: IL-10 group after 72 h.

假手術(shù)組 p53AIP1 蛋白表達(dá)各時(shí)間點(diǎn)均為弱陽(yáng)性[正常腦組織里有微量的凋亡細(xì)胞存在，可產(chǎn)生微量的凋亡蛋白。光密度比值（IOD ratio）≤0.05]，手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)的 p53AIP1 蛋白表達(dá)均為陽(yáng)性光[密度比值（IOD ratio）＞ 0.05]；手術(shù)組與假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn) p53AIP1 蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（各時(shí)間點(diǎn) P ＜ 0.01），且手術(shù)組中的 IL-10組和對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn) p53AIP1 蛋白表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（各時(shí)間點(diǎn) P ＜ 0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖 3 和4。

圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) p53AIP1 蛋白表達(dá)（A：白細(xì)胞介素-10組；B：對(duì)照組；C：假手術(shù)組）Figure 3 The expression of protein p53AIP1 was detected by Western blotting.A: IL-10 group; B: Control; C: Sham group.

圖4 p53AIP1蛋白光密度值Figure 4 The IOD ratio of p53AIP1

3 討論

腦缺血一定時(shí)間恢復(fù)血液供應(yīng)后，其功能不但未能恢復(fù)，卻出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦功能障礙，稱之為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIR）。腦缺血再灌注損傷目前認(rèn)為可能與自由基的生成、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸毒性、白細(xì)胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有關(guān)。急性局灶性腦缺血引起的缺血中心區(qū)死亡以細(xì)胞壞死為主，缺血中心區(qū)與正常腦組織之間的所謂半暗帶區(qū)域內(nèi)的神經(jīng)元細(xì)胞于再灌注后出現(xiàn)了遲發(fā)性神經(jīng)元死亡（delayed neuronal death，DND），此DND 表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡（programmed cell death，PCD），確切機(jī)制目前仍不完全清楚，尚需進(jìn)一步深入研究。而搶救這些 DND 神經(jīng)元、減少神經(jīng)元的凋亡正是臨床上的治療重點(diǎn)之一。

p53 調(diào)節(jié)的凋亡誘導(dǎo)蛋白 1（p53-regulated apoptosis-inducing protein l，p53AIP1）基因是2000年由日本東大醫(yī)科學(xué)研究所中村佑輔教授[3]帶領(lǐng)的研究小組首先發(fā)現(xiàn)的，其研究歷史短暫；目前認(rèn)為它是p53 下游的一個(gè)促凋亡基因，其表達(dá)受野生型 p53 的調(diào)控誘導(dǎo)，在 p53 依賴性的凋亡調(diào)控通路中起重要作用。在 p53AI P1 介導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中，p53AIP1 作為 BH3-only 樣蛋白，轉(zhuǎn)位于線粒體后激活 Bax[4]。Bax 在線粒體膜上寡聚化，形成一個(gè)跨膜通道，導(dǎo)致線粒體內(nèi)外膜之間的電勢(shì)能降低，細(xì)胞色素 C 釋放，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡途徑。在 p53 依賴性的促凋亡調(diào)控通路中，p53AIP1 通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜電化學(xué)梯度的方式介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而其在體內(nèi)的具體促凋亡機(jī)制目前仍不清楚。

IL-10 于 1989 年由 Dnax 研究所[5]首次在小鼠的 TH2 細(xì)胞培養(yǎng)上清中發(fā)現(xiàn)，1990 年，Moore將其命名為 IL-10[6-7]。IL-10 具有廣泛的生物學(xué)活性，在機(jī)體中主要起著免疫調(diào)節(jié)（免疫抑制及免疫刺激）和抗炎癥兩大作用。Dietrich 等[8]在全腦缺血小鼠海馬定量病理組織學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用IL-10 較單純應(yīng)用低溫療法更能提高神經(jīng)元存活率。在外傷性腦損傷，靜脈或皮下給予 IL-10，能提高神經(jīng)元的修復(fù)和存活能力。Van Exel 等通過(guò)對(duì)倫敦 599 名 85 歲以上老人血清 IL-10 水平分析后，發(fā)現(xiàn)低 IL-10 水平人群發(fā)生中風(fēng)的危險(xiǎn)性較高，指出抗炎因子 IL-10 在缺血性腦血管病中起著重要的保護(hù)作用[1,9]。Clarkson 等[10]發(fā)現(xiàn)，去除IL-10 的小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）后腦梗死的面積較正常野生型小鼠大 30%，在體外，其大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)興奮性神經(jīng)毒性的敏感性增加，對(duì)缺血缺氧耐受性較野生型小鼠差，而將重組IL-10 加入培養(yǎng)液后，則可減輕興奮性神經(jīng)毒性和缺血缺氧造成的損傷，結(jié)果說(shuō)明外源性及內(nèi)源性IL-10 在腦缺血時(shí)都具有神經(jīng)保護(hù)作用。以上研究證明，對(duì)于腦損傷，應(yīng)用 IL-10 治療可明顯減弱炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生重要的抗炎保護(hù)作用。

但目前對(duì)于 IL-10 的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不十分了解，推測(cè)IL-10 在急性腦缺血后抑制炎性反應(yīng)的機(jī)制，主要通過(guò)以下 3 個(gè)途徑：①減少 γ 干擾素（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和TNF-α 等前炎性細(xì)胞因子的合成[11-12]；②抑制炎性細(xì)胞因子受體表達(dá)；③降低炎性細(xì)胞因子活性[13]。IL-10 的抗炎保護(hù)作用始終與TNF-α水平降低有關(guān)，國(guó)外很多文獻(xiàn)在全身性疾病研究中有所報(bào)道[14-15]。IL-10能對(duì)多種類(lèi)型細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制和免疫激勵(lì)效力，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，是一種與腦缺血損傷和損傷修復(fù)過(guò)程相關(guān)的重要抗炎細(xì)胞因子。

本實(shí)驗(yàn)在觀察 MCAO 大鼠應(yīng)用 IL-10 與細(xì)胞凋亡的關(guān)系中，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用 IL-10 后無(wú)論哪個(gè)時(shí)間段，MCAO 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡情況均明顯低于對(duì)照組（P ＜ 0.01）。

本實(shí)驗(yàn)在研究中發(fā)現(xiàn)，腦組織 p53AIP1 蛋白在腦梗死再灌注后含量是呈動(dòng)態(tài)變化的。發(fā)病 24 h測(cè)得 p53AIP1 蛋白顯著增高，48 h達(dá)高峰，隨后逐漸下降，但發(fā)病第 3 天對(duì)照組仍顯著高于 IL-10組。

總之，我們認(rèn)為腦缺血急性期的機(jī)體免疫系統(tǒng)處于激活狀態(tài)，p53AIP1 蛋白在神經(jīng)元細(xì)胞損傷凋亡過(guò)程中扮演了一定角色，但具體情況尚缺乏足夠的研究；IL-10 是一種與腦缺血損傷和損傷修復(fù)過(guò)程相關(guān)的重要抗炎細(xì)胞因子，具有神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們可以確定 IL-10 對(duì)p53AIP1 蛋白的表達(dá)具有一定的抑制作用，其機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究；為將來(lái) IL-10 應(yīng)用于臨床積累經(jīng)驗(yàn)。

[1]Huber TS, Gaines GC, Welborn MB 3rd, et al.Anticytokine therapies for acute inflammation and the systemic inflammatory response syndrome: IL-10 and ischemia/reperfusion injury as a new paradigm.Shock, 2000, 13(6):425-434.

[2]Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.stroke, 1989, 20(1):84-91.

[3]Oda K, Arakawa H, Tanaka T, et al.p53AIP1, a potential mediator of p53-dependent apoptosis, and its regulation by Ser-46-phosphorylated p53.Cell, 2000, 102(6):849-862.

[4]Yang ZY, Yu P.BH3-only protein and apoptosis.J Xiangnan Univ(Med Sci), 2006, 8(2):70-73.(in Chinese)楊志英, 余平.BH3-only蛋白與凋亡.湘南學(xué)院學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2006,8(2):70-73.

[5]Moore KW, Vieira P, Fiorentino DF, et al.Homology of cytokine synthesis inhibitory factor (IL-10) to the Epstein-Barr virus gene BCRFI.Science, 1990, 248(4960):1230-1234.

[6]Liu N, Chen RH, Zheng A, et al.The study of the protective mechanism of interleukin-10 on cerebral ischemia in rats.Chin J Cerebrovasc Dis, 2004, 1(4):178-181.(in Chinese)劉楠, 陳榮華, 鄭安, 等.白細(xì)胞介素-10對(duì)大鼠腦缺血的保護(hù)作用.中國(guó)腦血管病雜志, 2004, 1(4):178-181.

[7]Xia CF, Huo Y, Tang CS.The study of the signal transduction and Cell Biology’s affection of Interleukin-10.Foreign Med Scie (Section Immunol Foreign Med Sci), 2001, 24(5):269-272.(in Chinese)夏春芳, 霍勇，唐朝樞.106 白細(xì)胞介素10的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè)), 2001, 24(5):269-272.

[8]Dietrich WD, Busto R, Bethea JR.Postischemic hypothermia and IL-10 treatment provide long-lasting neuroprotection of CA1 hippocampus following transient global ischemia in rats.Exp Neurol,1999, 158(2):444-450.

[9]van Exel E, Gussekloo J, Houx P, et al.Atherosclerosis and cognitive impairment are linked in the elderly.The Leiden 85-plus Study.Atherosclerosis, 2002, 165(2):353-359.

[10]Clarkson AN, Liu H, Schiborra F, et al.Angiogenesis as a predictive marker of neurological outcome following hypoxia-ischemia.Brain Res, 2007, 1171:111-121.

[11]Rabuffetti M, Sciorati C, Tarozzo G, et al.Inhibition of caspase-1-like activity by Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-chloromethyl ketone induces long-lasting neuroprotection in cerebral ischemia through apoptosis reduction and decrease of proinflammatory cytokines.J Neurosci,2000, 20(12):4398-4404.

[12]Sun YM, Tian Y, Li X, et al.Effect of atorvastatin on expression of IL-10 and TNF-alpha mRNA in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats.Biochem Biophys Res Commun, 2009, 382(2):336-340.

[13]Zhai QH, Futrell N, Chen FJ.Gene expression of IL-10 in relationship to TNF-alpha, IL-1beta and IL-2 in the rat brain following middle cerebral artery occlusion.J Neurol Sci, 1997, 152(2):119-124.

[14]Stoll G, Jander S, Schroeter M.Cytokines in CNS disorders:neurotoxicity versus neuroprotection.J Neural Transm Suppl, 2000,59:81-89.

[15]Cavriani G, Domingos HV, Oliveira-Filho RM, et al.Lymphatic thoracic duct ligation modulates the serum levels of IL-1beta and IL-10 after intestinal ischemia/reperfusion in rats with the involvement of tumor necrosis factor alpha and nitric oxide.Shock,2007, 27(2):209-213.