何佳聲，黃學(xué)鋒

實(shí)驗(yàn)研究

原花青素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620增殖和凋亡的影響

何佳聲1，黃學(xué)鋒2

目的：觀察葡萄籽提取物原花青素對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法：SW620細(xì)胞與20、40、60、80μg∕mL的原花青素共同孵育24 h～8 d，采用噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡情況，分光光度法檢測(cè)Caspase-3酶活性。結(jié)果：不同濃度(20～80μg∕mL）的原花青素對(duì)SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；含原花青素20、40、80μg∕mL的觀察組細(xì)胞凋亡發(fā)生率分別為6.9%、18.6%及22.9%，不含藥的對(duì)照組細(xì)胞凋亡發(fā)生率為1.3%。SW620細(xì)胞與含藥（40μg∕mL）或不含藥的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h或72 h，對(duì)照組細(xì)胞幾乎無(wú)法檢出Caspase-3酶活性，而給藥組細(xì)胞活性顯著增加。結(jié)論：原花青素在體外可呈濃度依賴性抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620的增殖并通過(guò)Caspase-3通路促進(jìn)其凋亡。

結(jié)腸癌；葡萄籽提取物原花青素；增殖；凋亡

原花青素(proanthocyanidins，PC)是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的一大類酚類化合物，廣泛分布于水果、豆類、巧克力等多種食物和水果汁、葡萄酒、啤酒、茶等飲料中[1]。近年來(lái)的研究顯示，原花青素可抑制乳腺癌、肺癌、胃癌、慢性骨髓白血病等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。據(jù)推測(cè)，其抗癌機(jī)制可能與其強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基能力、抗炎作用、調(diào)節(jié)信號(hào)分子如環(huán)氧酶-2、核因子-κB及阻滯細(xì)胞周期、抑制腫瘤血管生成等有關(guān)。原花青素在結(jié)腸癌中的相關(guān)作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，我們將不同濃度葡萄籽原花青素與人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620共同培養(yǎng)，觀察其對(duì)SW620細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，美國(guó))；胎牛血清(杭州四季青公司)；葡萄籽原花青素(南京青澤醫(yī)藥科技有限公司，純度≥95%，以無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基配成10 mg/mL的母液，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存)；MTT (Amresco，美國(guó))；DMSO(Sigma，美國(guó))；胰蛋白酶（Amresco，美國(guó))；其他常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。倒置顯微鏡(Olympus，日本)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀(ELX800 G型，美國(guó))；流式細(xì)胞儀(BD FACSCalibur，美國(guó))。Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液，置于含5%CO2培養(yǎng)箱中，在37℃、95%濕度條件下培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620。0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA消化、傳代細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，每孔100μL，貼壁24 h后換液，隨后分為對(duì)照組和4個(gè)不同濃度的原花青素試驗(yàn)組，共5組。其中對(duì)照組用含終濃度為0.1%DMSO完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，試驗(yàn)組則分別以含20、40、60、80μg/mL原花青素（0.1%DMSO）的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。每組均設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。噻唑藍(lán)(MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)活力。分別于加藥后2～8 d(每48 h換液1次，換液時(shí)保證各組完全培養(yǎng)液中的原花青素濃度不變)每孔加入50μL MTT(2 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h。4 h后棄去孔內(nèi)液體，每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的OD值，求出每一組的平均OD值。

1.4 細(xì)胞周期分析將上述細(xì)胞處理后置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h；每組設(shè)3個(gè)復(fù)選孔。用胰酶消化細(xì)胞，并收集原培養(yǎng)上清置于5 mL離心管中，2 000 g離心10 min；去上清液后，用PBS緩沖液洗細(xì)胞兩遍；去上清液后每管加入預(yù)冷70%乙醇，4℃冰箱內(nèi)過(guò)夜保存；再用PBS緩沖液洗細(xì)胞兩遍，去上清液，每管加入碘化丙啶（PI）至終濃度為50 μg/mL，混勻，4℃避光PI熒光染色；在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行細(xì)胞周期分析。FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細(xì)胞周期的變化。

1.5Caspase-3酶活性測(cè)定將上述處理后的細(xì)胞以600 g 4℃離心5 min，收集細(xì)胞，小心吸除上清，PBS洗滌1次。吸盡上清后，按每200萬(wàn)細(xì)胞加入100μL裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15 min，4℃16 000～20 000 g離心10～15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預(yù)冷的離心管中，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定caspase-3酶活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法全部統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以±s)表示，組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)SW620細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響含原花青素20～80μg/mL的完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)2～8 d期間，與不含藥物的對(duì)照組相比，可呈劑量依賴性地抑制SW620細(xì)胞生長(zhǎng)（見(jiàn)圖1）。在培養(yǎng)48 h后，觀察到其IC50（半數(shù)抑制濃度）為45.07μg/mL。

2.2 對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響SW620細(xì)胞與含原花青素20～80 μg/mL的完全培養(yǎng)基或不含藥的完全培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h后，收集全部培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，不含藥的對(duì)照組細(xì)胞凋亡發(fā)生率為1.3%，含原花青素20、40、80 μg/mL的觀察組細(xì)胞凋亡發(fā)生率分別為6.9%、18.6%及22.9%，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 不同濃度原花青素對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05,**P＜0.01

圖3 不同濃度原花青素對(duì)SW620細(xì)胞凋亡的影響

2.3 對(duì)Caspase-3酶活性的影響SW620細(xì)胞與含藥（40 μg/mL）或不含藥的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)48 h或72 h，對(duì)照組細(xì)胞幾乎無(wú)法檢出Caspase-3酶活性（0.13±0.05）;（0.15±0.04）nmol pNA/mg蛋白，而給藥組細(xì)胞活性（5.09±1.23）、（21.31±3.97）nmol pNA/mg蛋白顯著增加（見(jiàn)圖4）。

圖4 原花青素對(duì)SW620細(xì)胞Caspase-3酶活性的影響

3 討論

研究表明，人類多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是其細(xì)胞凋亡過(guò)程嚴(yán)重受阻，從而使腫瘤細(xì)胞在數(shù)量上無(wú)限惡性增生的結(jié)果，這種增殖與死亡的平衡失調(diào)被認(rèn)為是由細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂所引起。細(xì)胞凋亡在控制細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和生長(zhǎng)中起著關(guān)鍵作用。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。臨床上常用的化療藥物多具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，但常有較大的毒副作用，長(zhǎng)期使用也易產(chǎn)生耐藥性。因此，從天然動(dòng)植物中尋找抗癌新藥越來(lái)越受到人們的重視。原花青素是存在于多種植物中具有強(qiáng)大抗氧化能力的一大類酚類化合物，對(duì)皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等都有一定的防治作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)原花青素可明顯抑制結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)，該藥在45.07 μg/mL可使半數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，在80 μg/mL可完全抑制SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)。原花青素抑制SW620細(xì)胞的生長(zhǎng)可能與其阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。在對(duì)細(xì)胞Caspase-3酶活性的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了原花青素可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

原花青素可能通過(guò)多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用。自由基導(dǎo)致DNA損傷且抑制損傷后的修復(fù)，是自由基誘導(dǎo)細(xì)胞癌變的主要原因。原花青素在體內(nèi)抗氧化能力是維生素E的50倍，維生素C的20倍。因此，其強(qiáng)大的抗氧化和清除自由基的能力，可能是其抗腫瘤的主要機(jī)制之一。腫瘤性疾病與局部炎癥反應(yīng)有關(guān)。在原花青素對(duì)小鼠紫外線光致癌的保護(hù)作用的研究中發(fā)現(xiàn)，原花青素能通過(guò)IL-12誘導(dǎo)阻止紫外線誘導(dǎo)的免疫系統(tǒng)抑制，發(fā)揮抗癌作用[2]。原花青素還可通過(guò)對(duì)信號(hào)分子的調(diào)節(jié)發(fā)揮抗腫瘤作用。原花青素能抑制人表皮癌A431細(xì)胞中環(huán)氧酶-2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[3]。原花青素能降低A431細(xì)胞中蛋白激酶B的磷酸化，后者可以在磷脂酰肌醇-3激酶激活后磷酸化并促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)[4]。原花青素能減少小鼠乳腺癌4T1細(xì)胞和人表皮癌細(xì)胞A431中Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)增加Bax的表達(dá)，Bax/Bc1-2的高比率導(dǎo)致caspase的斷裂，進(jìn)而發(fā)生凋亡[5]。葡萄籽原花青素能降低細(xì)胞周期素依賴激酶-2、4、6及細(xì)胞周期素D1、D2和E表達(dá)水平，使細(xì)胞周期阻滯[6]。此外，從日本木瓜中提取的原花青素是基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9的有效抑制劑，抑制腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移[7]。

本研究將原花青素作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞SW620后，發(fā)現(xiàn)其能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并能誘導(dǎo)其凋亡，這為探尋天然藥物在結(jié)腸癌治療方面的研究和應(yīng)用開(kāi)拓了新的思路，但該藥在防治結(jié)腸癌中的詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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（收稿：2009-12-12修回：2010-04-20）

（責(zé)任編輯劉洪斌田在善）

Effect of Grape Seed Procyanidin Extract on Proliferation and Apoptosis of Human Colon Cancer Cell Line SW620

He Jiasheng,Huang Xuefeng.The Second Peoples’Hospital,Fuyang City,Zhejiang Province Fuyang(311404),China

ObjectiveTo observe the effects of grape seed procyanidin extract on proliferation and apopto?sis of human colon cancer cell line SW620.MethodsSW620 cells and culture media with procyanidin(20, 40,60,80 μg∕mL)were co-incubated for 24 h or 8 days.Cell proliferation rate,cell apoptosis and caspase-3 ac?tivity were determined by methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)colorimetric assay,flow cytometry analysis and spec?trophotometric detection respectively.ResultsThe growth of SW620 cells was significantly inhibited by differ?ent concentrations(20-80 μg∕mL)of procyanidin in a dose-dependen manner.Apoptosis rates in the cells of the observer group containing procyanidin(20,40,80 μg∕mL)were 6.9%,18.6%and 22.9%respectively,which was 1.3%in the control group.SW620 cells and culture media with drug(40 μg∕mL)ornot were co-incubated for 48 h or 72 h,caspase-3 activity was hardly determined in the control group cells,while the activity was significant?ly increased in the treatment group.ConclusionThe procyanidin can inhibit the proliferation of colon cancer cell line SW620 in vitro in a dose-dependent manner and promote cell apoptosis through caspase-3 pathway.

colon cancer,grape seed extract proanthocyanidins,proliferation,apoptosis

R735.3+5

A

1007-6948(2010)04-0439-04

10.3969∕j.issn.1007-6948.2010.04.015

1.浙江省富陽(yáng)市第二人民醫(yī)院外科(富陽(yáng)311404)

2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院肛腸科