辛海濤 王衛(wèi)寧

缺氧誘導(dǎo)因子-1[1](HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物及人體的一種轉(zhuǎn)錄因子。迄今發(fā)現(xiàn)HIF-1的直接啟動(dòng)基因有60多個(gè)，其中包括一些對(duì)缺氧適應(yīng)性基因，如促紅細(xì)胞生成基因、EPO編碼基因等，還有一些HIF-1依賴(lài)的凋亡相關(guān)基因，如caspase、RTP801、bcl-2等。在嚴(yán)重缺血缺氧時(shí)，HIF-1可激活凋亡途徑，HIF-1誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡在缺血缺氧損傷的病理過(guò)程中起重要作用。RTP801[2]是HIF-1α依賴(lài)的凋亡相關(guān)基因，嚴(yán)重的局灶性腦缺血時(shí)，HIF-1促進(jìn)RTP801的表達(dá)，神經(jīng)元凋亡增加。凋亡在腦缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用[3]，且在梗死形成過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。梔子苷對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[4]，但機(jī)制尚不明確。為此本研究采用大鼠腦缺血再灌住模型，觀察藥物對(duì)腦組織細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑關(guān)鍵蛋白HIF-1α的含量和HIF-1依賴(lài)的凋亡相關(guān)基因RTP801 mRNA表達(dá)的影響，深入研究其腦保護(hù)的分子機(jī)制。

表1 免疫組織化學(xué)染色顯示各組大鼠海馬CAI區(qū)HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/高倍視野，40×10倍)

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠(體重300～350g)，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、梔子苷(低劑量、中劑量、高劑量)組和尼莫地平組，后者為陽(yáng)性對(duì)照組，每組均為8只動(dòng)物。

1.2 動(dòng)物模型制作 參照Longa法[5]，用3.5%的水合氯醛(350mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，手術(shù)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery，CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery，ICA)，結(jié)扎ECA和CCA近心端，于CCA遠(yuǎn)心端備線(xiàn)，于ICA近心端置一動(dòng)脈夾，在CCA近分叉處剪一約0.2mm的‘V’字形切口，插入栓線(xiàn)，插入深度(18.5±0.5)mm，使栓線(xiàn)進(jìn)入ICA，到達(dá)大腦前動(dòng)脈(anterior cerebral artery，ACA)起始部，阻斷大腦中動(dòng)脈的血液供應(yīng)。假手術(shù)對(duì)照組不插入栓線(xiàn)，其他步驟同模型組。選取模型成功的標(biāo)志為大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)Horner征和對(duì)側(cè)以前肢為重的偏癱。

1.3 給藥方式及途徑 采用腹腔注射方式給藥，梔子苷(低劑量、中劑量、高劑量)組、尼莫地平組造模前1h均預(yù)防性給藥1次。各給藥組分別給藥3、6、12、3mL/kg，給藥用生理鹽水稀釋至24mL/kg間隔4h第2次給藥，2次給藥后10h第3次給藥。模型組腹腔注射生理鹽水24mL/kg，梔子苷由課題組制備，濃度4.0mg/mL；尼莫地平購(gòu)至拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)J20050050，規(guī)格0.2mg/mL。

1.4 免疫組化 各組動(dòng)物缺血1h，再灌住24h，迅速斷頭、取腦。取視交叉前后1mm腦組織做石蠟切片。石蠟切片用于免疫組化染色，一抗為HIF-1α的單克隆抗體為1∶100(Santa Cruz公司，美國(guó))，二抗及辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素為1∶200(北京中山生物技術(shù)有限公司)，DAB鏡下顯色。HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞是細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核著色呈棕黃色。每張切片均在左側(cè)大腦皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)，高倍視野下(40×10)計(jì)數(shù)200個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 RT-PCR 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，在冰盒上迅速分離雙側(cè)海馬，置凍存管中后放于-80℃低溫冰箱保存。Trizol試劑盒提取-80℃保存的腦細(xì)胞總RNA，程序參照試劑盒操作手冊(cè)，反應(yīng)體系20μL，核酸分析儀對(duì)RNA樣品定量。RT-PCR反應(yīng)引物由寶生物公司合成，RTP801上游引物：5’-AAGAGCTGCCATAGTGTGGCT-3’，下游引物：5’-TTCAGACCATGAGATCTGTCG-3’；β-actin上游引物：5’-ATGGATGACGTATCGCTG-3’，下游引物：5’-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’，PCR程序：94℃2min，94℃30s，56℃30s，72℃45s共35個(gè)循環(huán)，72℃5min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物5μL 加樣于2%瓊脂糖凝膠，常規(guī)電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，用Bio-rad凝膠分析系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行半定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，結(jié)果以(±s)表示，采用t檢驗(yàn)。

圖1 RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

2 結(jié)果

2.1 梔子苷對(duì)缺血腦組織HIF-1α表達(dá)的影響 各組大鼠海馬CAI區(qū)HIF-1α的表達(dá)詳見(jiàn)表1。假手術(shù)組亦有少量表達(dá)，模型組的表達(dá)增加，各治療組的表達(dá)比模型組減少，并且呈劑量依賴(lài)性，但仍高于假手術(shù)組，各治療組HIF-1α的表達(dá)與假手術(shù)組、模型組相比都有顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 RT-PCR檢測(cè)RTP801 mRNA的表達(dá) 在假手術(shù)組大鼠海馬中未見(jiàn)RTP801mRNA的表達(dá)，而模型組中可見(jiàn)RTP801mRNA的表達(dá)增加，治療組中RTP801mRNA的表達(dá)與模型組相比減少，而且隨著治療藥物劑量的增加，RTP801 mRNA的表達(dá)量逐漸減小(圖1)。

3 討論

梔子苷治療后大鼠海馬CAI區(qū)HIF-1α的表達(dá)量下降，與模型組、尼莫地平組相比都有顯著性差異(P＜0.05)；RTP801 mRNA的表達(dá)與模型組相比減少，而且隨著治療藥物劑量的增加，RTP801 mRNA的表達(dá)量逐漸減小。本實(shí)驗(yàn)證明梔子苷對(duì)局灶性腦缺血急性期的神經(jīng)保護(hù)作用，其可能機(jī)制之一為梔子苷抑制局灶性腦缺血損傷引起的的HIF-1α過(guò)渡表達(dá)，減少HIF-1依賴(lài)性凋亡相關(guān)基因RTP801的表達(dá)，減少神經(jīng)元凋亡，從而減輕了缺血造成的損傷，起到了一定的神經(jīng)保護(hù)作用，其作為腦缺血臨床治療具有一定的前景。但是，關(guān)于梔子苷在局灶性腦缺血病理過(guò)程中的應(yīng)用最佳劑量、最佳時(shí)期以及副作用等方面還有待于進(jìn)一步深入探討。

[1]王晗,韓忠朝.缺氧誘導(dǎo)因子-1與細(xì)胞凋亡[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):生理.病理科學(xué)與臨床分冊(cè),2005,25(1):52-54.

[2]Tzipora Shoshani,Alexander Faerman,IgorMett,et al.Identification of a novel hypoxia-inducible factor 1-Responsive Gene,RTP801，involved in apoptosis[J].Molecular and Cellular Biology,2002,22(7):2283-2293.

[3]馮俊奇,李秀蘭,白人驍.細(xì)胞凋亡機(jī)制研究進(jìn)展[J].國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2006,29(1):45-64.

[4]張小燕,張占軍,王忠,等.梔子苷對(duì)局灶性腦缺血大鼠腦組織基因表達(dá)譜的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2005,25(1):42-44.

[5]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.