張朝薔 薄建萍 李江波
支氣管哮喘是多種細胞和細胞成分參與的氣道慢性炎癥性疾病,氣道炎癥和氣道高反應是支氣管哮喘的特點。近年來,氣道重塑在支氣管哮喘發(fā)病中的作用受到高度重視,被認為是引起不可逆的氣道阻塞和氣道高反應的病理基礎[1]。PDGF是1974年才發(fā)現的一種肽類調節(jié)因子,貯存于血小板的α顆粒中,當血小板被激活后,PDGF與血小板因子、β血小板球蛋白等一起釋放出來。體內多種細胞可以產生和分泌PDGF[2]。PDGF-BB為PDGF家族中的主要成員之一,它是由PDGF-B鏈通過二硫鍵而形成的同源二聚物[3]。PDGF-BB具有強烈的促進氣道平滑肌增殖、促進成纖維細胞的增生及膠原蛋白的合成作用,研究發(fā)現,氣道上皮損傷后PDGF釋放增多,并能促進共培養(yǎng)體系中肌成纖維細胞增生,因此,PDGF-BB被認為與哮喘過程中氣道平滑肌增生肥厚、氣道痙攣及氣道上皮纖維化有關[4]。本文通過觀察PDGF-BB在不同程度的氣道重塑中的表達變化,探討了PDGFBB與氣道重塑的關系及地塞米松的干預作用。
1.1 材料 選擇SPF級Wistar雄性大鼠40只,2~3月齡,體重160~180g(由山西醫(yī)科大學生理動物實驗室提供)。卵白蛋白(ovalbumin,OVA)(由美國sigma公司生產);氫氧化鋁(Aluminum hydroxide,AL(OH)3)(由天津化學試劑三廠生產);PDGF-BBSP 免疫組化試劑盒(由北京博奧森生物技術有限公司生產)二抗及DAB顯色劑(由北京博奧森生物技術有限公司生產)。彩云JWC-201D型霧化器(由鞍山市同信醫(yī)用儀器廠生產);BH-2型光學顯微鏡(由日本Olympus公司生產);LY-WN-HP SUPER CCD萬能視頻成像裝置(由成都勵揚精密機電有限公司生產);BI-2000醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)(由成都泰盟科技公司提供)。
1.2 制備動物模型 將40只大鼠隨機分為對照組(control group,C組)、模型組(non-intervention group,N組)、早期干預組(early-intervention group,E組)和晚期干預組(late-intervention group,L組),每組各10只。實驗于第1、8天,E組、L組和N組每只大鼠腹腔注射10%卵白蛋白抗原混懸液(內含生理鹽水加卵蛋白100mg,氫氧化鋁干粉100mg)1ml致敏;C組腹腔注射等量的生理鹽水;第15天,E組、L組和N組開始用1%卵白蛋白超聲霧化吸入誘導哮喘發(fā)作,1次/d,20min/次,共8周;C組用生理鹽水霧化吸入,1次/d,20min/次,共8周。其中,E組每只大鼠在每次霧化前1h腹腔注射地塞米松0.5mg/kg;從霧化第15天始,L組每只大鼠在每次霧化前1h腹腔注射地塞米松0.5mg/kg;C組用生理鹽水代替,注射劑量相同。以出現點頭運動、呼吸急促、腹肌收縮、兩便失禁為哮喘發(fā)作標志[5-6]。
1.3 標本制備 每只大鼠在末次霧化后的24h內用25%烏拉坦0.4ml/100g腹腔注射麻醉,開胸取右肺中葉,4%多聚甲醛溶液中固定1周,常規(guī)石蠟包埋,切片,分別做HE染色及免疫組化染色。
1.4 圖像分析
1.4.1 HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測量支氣管基底膜周徑(Pbm)、支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內氣管面積(AMe)、平滑肌內緣內氣管面積(AMi)。計算公式:支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbm;平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm;衡量氣道重塑程度[7]。
1.4.2 測定PDGF-BB表達區(qū)平均光密度值 高倍鏡下,每張免疫組化切片取5個視野,測定每個視野陽性表達區(qū)的平均光密度值,取其均值為PDGF-BB的相對含量。
1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS16.0專用統(tǒng)計軟件,多組間比較采用方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t法,兩個變量間的關系采用線性相關分析,結果以均數±標準差(±s)表示,P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
表1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度(um)
表2 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達區(qū)的平均光密度值
2.1 肺組織病理學改變 光鏡下觀察N組大鼠氣道壁及氣道平滑肌明顯的增厚,黏膜皺褶增多,黏膜下層增寬,管腔狹窄,有時可見黏液栓堵塞,氣道上皮細胞脫落,黏膜下及管周有大量的炎性細胞浸潤(以嗜酸粒細胞和淋巴細胞為主)。E組較上述的病理變化明顯減輕。L組的病理變化介于N組、E組之間。C組幾乎無上述病理變化。
2.2 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度測定(見表1)。
2.3 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達的測定(見表2)。
2.4 統(tǒng)計學分析結果
2.4.1 各組大鼠支氣管管壁厚度和平滑肌厚度比較 各組大鼠支氣管管壁厚度數據方差分析得F=126.88,P<0.01;進一步進行LSD-t法,任何兩組間支氣管管壁厚度比較,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同樣,各組大鼠支氣管平滑肌厚度數據經方差分析得F=125.47,P<0.01;進一步進行LSD-t法,任何兩組間支氣管平滑肌厚度比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.4.2 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達區(qū)的平均光密度的比較 各組大鼠肺組織中PDGF-BB表達區(qū)平均光密度數據由方差分析得F=222.10,P<0.01;進一步進行LSD-t法,任何兩組間PDGF-BB表達區(qū)平均光密度比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。E組低于N組和L組(P<0.05);C組低于E組(P<0.05);L組低于N組(P<0.05)。
2.4.3 各組大鼠PDGF-BB與支氣管管壁厚度及平滑肌厚度之間的關聯性分析 繪散點圖知,PDGF-BB濃度與支氣管管壁厚度呈線性趨勢,Pearson相關系數r=0.96(t=9.70,P<0.001),表明肺組織中的PDGF-BB濃度與支氣管管壁厚度間呈線性正相關;同樣,繪散點圖知,肺組織中PDGF-BB濃度與平滑肌厚度也呈線性趨勢,Pearson相關系數r=0.98(t=13.92,P<0.001),表明肺組織中的PDGF-BB濃度與平滑肌厚度間也呈線性正相關。
氣道重塑指發(fā)生在大小氣道的結構改變,在支氣管哮喘中氣道結構的改變包括上皮下纖維化,平滑肌增生,腺體增生肥大,新生毛細血管形成和上皮改變。氣道改變導致了氣道壁增厚從而使得氣道變窄,氣道高反應,氣道壁水腫和黏液分泌增多,被認為是難治性哮喘的重要病理基礎。在這些病理過程中,氣道平滑肌增生是哮喘氣道重塑的一個主要特點[1]。有研究表明,PDGF-BB在肺組織中表達增多,被認為可能與氣道重塑和氣道平滑肌增生有關。研究還表明PDGF-BB是經STAT通路誘導平滑肌增生[8]。從本實驗結果中,我們看到早期干預組、晚期干預組和模型組中氣道重塑的程度逐漸加重,而PDGF-BB濃度隨著氣道重塑程度的加重也呈上升趨勢,兩者關聯分析發(fā)現存在線性正相關,由此可見,PDGF-BB與支氣管哮喘氣道重塑有著密切的關系。哮喘治療的首選藥物為糖皮質激素[9]。在本實驗中,應用地塞米松干預后,早期干預組氣道重塑程度較模型組明顯減輕,而晚期干預組介于兩者之間,其可能是通過下調了PDGF-BB而起作用,也表明早期使用糖皮質激素可以延緩氣道重塑的過程,但不能逆轉。該實驗提示,臨床哮喘患者應早期診斷和早期使用糖皮質激素。另外,使用PDGF-BB拮抗劑可能延緩氣道重塑,但這一觀點尚需進一步大量的臨床實驗研究來證實。
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