劉興偉 遼寧省畜牧科學(xué)研究院 110000

趙圓圓 遼寧省信息中心 110000

張文軍 韓迪 豆興堂 李豐田 遼寧省畜牧科學(xué)研究院 110000

1 范圍

本規(guī)程適用于遼寧絨山羊品種，規(guī)定了遼寧絨山羊細管冷凍精液的技術(shù)要求、制作程序、解凍方法、檢驗方法、標(biāo)識、包裝、存放、取用和運輸及容器清洗方法。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件中的條款通過本規(guī)程的引用而成為本規(guī)程的條款。凡是注明日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本規(guī)程，然而鼓勵根據(jù)本規(guī)程達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本規(guī)程。

GB 5458液氮生物容器GB/T 1.1-1993標(biāo)準編寫的基本規(guī)定GB/T 1.2-1996標(biāo)準出版印刷的規(guī)定

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準。

精子密度：指1m L精液中的精子數(shù)。有效精子數(shù)：有效精子數(shù)=精液量×密度×活力。精子活力：指37℃環(huán)境下直線運動精子占總精子數(shù)的百分率。

精子頂體完整率：指頂體完整精子占總精子數(shù)的百分率。精子畸形率：指畸形精子占總精子數(shù)的百分率。精子存活率：指在37℃環(huán)境下保存4小時時直線運動精子占總精子數(shù)的百分率。

細菌數(shù)：取0.20m L解凍后的凍精經(jīng)培養(yǎng)24小時后出現(xiàn)的細菌菌落數(shù)。

4 規(guī)格與質(zhì)量

4.1 劑型

0.25m L細管凍精。

4.2 質(zhì)量標(biāo)準

（1）精子活力≥30%。

（2）每劑細管凍精有效精子數(shù)≥1500萬個。

（3）精子畸形率≤20%。

（4）精子頂體完整率≥50%。

（5）細菌數(shù)≤1000個。

（6）解凍后的精子存活時間

在5℃-8℃條件下保持30%活力的時間≥12小時，在37℃條件下保持30%活力的時間≥4.5小時。

（7）細管凍精標(biāo)識

在凍精細管上應(yīng)打印有生產(chǎn)場家、品種、羊號、批號和生產(chǎn)日期。

（8）灌裝后的細管必須封口嚴密,在解凍時不能進水,前端有0.8cm的空隙。

5 制作程序

5.1 采精種公羊的標(biāo)準

用于制作凍精的種公羊，其體型、外貌和生產(chǎn)性能應(yīng)合乎本品種的種用公羊一等以上標(biāo)準，體質(zhì)健壯，無下列傳染?。翰剪斒蠗U菌病、副結(jié)核病、口蹄疫和藍舌病。

5.2 采精方法

應(yīng)用假陰道法進行采精。

5.3 原精液檢查

原精顏色為乳白色或淡黃色,精子密度≥15×107/ml,活力≥60%,畸形率≤10%，可用于制作細管凍精。

5.4 原精液的稀釋

（1）器具衛(wèi)生

所用器具保證清潔、無菌、無消毒劑殘留。

（2）稀釋保護劑的配制

配制凍精用的稀釋保護劑，必須用新鮮的雙重蒸餾水、卵黃或在保質(zhì)期的無動物來源的精子細胞膜保護劑，其他藥品要符合國家相關(guān)行業(yè)規(guī)定的標(biāo)準。

5.5 降溫平衡

稀釋后的精液經(jīng)1-1.5小時降溫到4℃-5℃，然后在此溫度下平衡2-4小時。

5.6 冷凍

將平衡后的細管精液移至－95℃±5℃環(huán)境,冷凍3分鐘,然后浸入液氮中。

6 解凍方法

將液氮中的細管凍精取出,立即浸沒于38℃-40℃的溫水中,輕輕擺動約20秒鐘取出,用干凈紗布擦干。

7 解凍后的檢查方法

檢查細管凍精的質(zhì)量時,每只種羊的細管凍精抽檢1-2劑。解凍檢測合格的細管凍精入庫后,每半年進行一次檢查。

7.1 解凍活力檢查

選擇細管凍精上、中、下三個部位的精液在顯微鏡下觀察3-5個視野，應(yīng)用目測法統(tǒng)計出視野中呈直線運動的精子占總精子數(shù)的比例,估算出解凍后的平均活力。

7.2 有效精子數(shù)測定

用分光光度儀、紅細胞計數(shù)器或精子密度檢測儀測得原精液的精子密度,根據(jù)稀釋倍數(shù)和解凍后活力,推算出每劑細管凍精的有效精子數(shù)。

7.3 頂體完整率和畸形率測定

用姬姆薩染色法或1000倍的帶光柵的相差顯微鏡觀測細管凍精的頂體完整率和畸形率，每個樣品觀察精子總數(shù)≥500個。

7.4 解凍后存活時間測定

取同一批次的細管凍精10劑,解凍后浸入37℃的溫水中,先測定第1劑細管凍精的活力,然后每隔0.5小時,觀測第2劑細管凍精的活力,依此類推,直到水中的細管凍精的精子全部死亡或活力降到30%為止,由此計算出至精子全部死亡時的存活時間和解凍活力降至30%時的存活時間。

7.5 細菌數(shù)檢查

取0.20m L解凍后的精液樣品，放入血清瓊脂平面上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)24小時，統(tǒng)計出現(xiàn)的菌落數(shù)。

8 包裝

采用指形管包裝。

9 細管凍精的保存和取用

9.1 保存

貯存于裝有液氮的生物容器內(nèi),并定期添加液氮,使細管凍精始終浸沒于液氮中。在每個包裝袋上注明種羊羊號、解凍后活力和數(shù)量，不得將不同品種的絨山羊細管凍精混裝于同一個凍精袋中或同一個指形管中。

9.2 取用

在取細管凍精時,將凍精袋提升到液氮罐頸口下約10cm處,用長鑷子迅速將細管凍精取出進行解凍,操作時間≤10秒鐘,如想繼續(xù)取出細管凍精,則將凍精包裝袋浸入液氮中,再重復(fù)以上操作,取出的細管凍精停留在空氣中的時間≤5秒鐘。

10 容器清洗

液氮生物容器應(yīng)在使用前后徹底檢查和清洗。清理時先用中性洗滌劑刷洗，再用40℃-45℃溫水沖洗干凈，在室溫下放置48小時以上再充入液氮。長期貯存凍精的容器應(yīng)定期清洗。

11 運輸

必須使用超低溫生物運輸容器進行運輸。

（略）