董 浩,馬 磊,單曉楓,胡桂學(xué)

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長春 130118)

小鵝瘟即鵝的細小病毒病(GPV),又稱Derzsy′s病,是雛鵝和雛番鴨的一種急性或亞急性敗血性傳染病,主要侵害3～20日齡雛鵝和雛番鴨,以出血性、纖維素性、滲出性腸炎為主要特征。該病傳染快,發(fā)病率和死亡率高,是嚴(yán)重危害養(yǎng)鵝業(yè)的重要傳染病之一。

近幾年,吉林省多個地區(qū)的鵝業(yè)公司從匈牙利引進霍爾多巴吉白鵝種蛋進行孵化,擴充商品鵝資源?；魻柖喟图座Z具有個體大、體質(zhì)健壯、抗病力強,可供多次活體拔毛,產(chǎn)絨率高、羽絨品質(zhì)好,與當(dāng)?shù)仄胀ò座Z相比具有明顯的優(yōu)勢。本試驗是在吉林省某鵝廠病死的霍爾多巴吉雛鵝體內(nèi)進行采樣鑒定,以確定其病因。

1 材料與方法

1.1 病料與鵝胚 病料取自吉林省某鵝廠10日齡霍爾多巴吉病死雛鵝組織;10日齡鵝胚由吉林省獸醫(yī)研究所提供。

1.2 主要試劑與工具酶 小鵝瘟標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由本實驗室收藏;Tag酶,PCR相關(guān)試劑盒,膠回收試劑盒均購于TaKaRa(寶生物工程(大連)有限公司)。

1.3 病毒分離 無菌采集雛鵝肝、脾、胰腺等組織,剪碎,十字勻漿器研磨,以生理鹽水制成1∶1勻漿;低溫凍融3次,加雙抗1000 IU(μg),37℃感做30 min;10000 r/min離心20 min,取上清液待檢。取9～11日齡鵝胚,劃蛋,打孔,取處理好的上清液接種0.2 mL/枚,封孔,37℃孵化。孵化期間每8 h觀察1次,棄去24 h內(nèi)死亡鵝胚,24 h后死亡的以及5 d后仍未死的鵝胚取出4℃保存。將保存的致死鵝胚和未死亡鵝胚無菌操作收集鵝胚尿囊液,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒的電鏡觀察 取鵝胚尿囊液,12000 r/min離心10 min,取上清液置于銅網(wǎng)上,2%磷鎢酸負染1～2min,電鏡觀察并照相。

1.5 小鵝瘟病毒的PCR檢測

1.5.1 引物的設(shè)計 根據(jù)鵝細小病毒基因序列(Gen Bank登錄號為GPU25749)設(shè)計并合成了1對引物P1/P2,擴增 GPV VP3基因片段 375 bp,由大連TaKaRa公司合成[1]。

P1:5′-CCAAGCTACAACAACCACATCTAC-3′;P2:5′-CTGCGGCAGGGCATAGACATCCGAC-3′

1.5.2 目的基因的擴增 以待檢病毒鵝胚尿囊液為模板,以P 1、P2為引物,進行PCR擴增目的基因。PCR反應(yīng)體系如下:10×Ex Taq Buffer 2.5μL,P1(20 pmol/μL)0.5 μL,P2(20 pmol/μL)0.5 μL,dNTP 2μL,模板DNA 2.5μL,四餾水 16.5μL,Ex TaqTMDNA聚合酶0.5μL,PCR反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性 5 min,94℃變性 1 min、54℃退火 1 min、72℃延伸2 min,共30個循環(huán);最后72℃徹底延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.6 ELD50的檢測 取1.3分離的病毒尿囊液,進行10倍系列稀釋,并加入適量抗生素,過濾除菌。按0.2 m L/胚的接種量進行尿囊腔接種,每個稀釋度接種6枚鵝胚,37℃孵育7 d。記錄每個稀釋度的死胚數(shù)。按Reed和Muench法[2]計算ELD50。

1.7 瓊脂擴散試驗[3]瓊脂平板制作按參考文獻[3]配制,打孔、封底。中心孔加入抗GPV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,周圍孔分別加入接病料后的待測鵝胚尿囊液,以及空白對照和新城疫病毒陰性對照,濕盒37℃孵育18～36 h,觀察試驗結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果 接種病料后鵝胚絨毛尿囊膜增厚,胚胎充血,翅膀、胸部、背部和頭部均有出血點。大多數(shù)鵝胚死亡時間為3～5 d。

2.2 電鏡觀察結(jié)果 由電鏡負染結(jié)果可知,病毒粒子直徑約為20～22 nm左右,無囊膜,呈圓形或多角形,具有典型的鵝細小病毒特征。

2.3 PCR擴增結(jié)果 對樣品進行PCR擴增,經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下可見375 bp左右大小的片段,見圖1。

2.4 ELD50測定結(jié)果 病毒的ELD50結(jié)果見表1,按 Reed和Muench法計算 ELD50。

根據(jù)表1,得到A株的ELD50:距離比值=(76.9-50)/(76.9-33.3)=0.62;lg ELD50=-5+0.62×(-1)=-5.62;ELD50=10-5.62/0.2 m L。

圖1 PCR擴增結(jié)果

表1 A株ELD50的測定結(jié)果

2.5 瓊脂擴散試驗結(jié)果 待檢病毒與GPV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清出現(xiàn)比較清晰的沉淀線,而空白對照和新城疫病毒陰性對照均未出現(xiàn)沉淀線。

3 討論

本次試驗分離到的病毒株可以使鵝胚產(chǎn)生特征性病變并致死,通過電鏡觀察、PCR檢測、血清學(xué)檢查,均表明該病毒具有小鵝瘟病毒的典型特征,從而確認所分離到的病毒為小鵝瘟病毒。ELD50的測定結(jié)果為10-5.62/0.2 mL,與其他地區(qū)相關(guān)報道的小鵝瘟病毒的毒力相比要略高一些,這也正說明了小鵝瘟毒力的多變,對預(yù)防和治療都增加了不小難度[4]。

本次發(fā)病的鵝群為霍爾多巴吉白鵝,此品種白鵝從匈牙利以種蛋形式引進我省,此次小鵝瘟病毒來源尚不能確定,種蛋帶毒的可能也是存在的,需要進一步檢驗。

[1] 胡桂學(xué),高光,鄒嘯環(huán),等.小鵝瘟病毒分離與初步鑒定[J].經(jīng)濟動物學(xué)報,2002,6(2):411-433.

[2] 李桂霞,劉勝旺,孔憲剛,等.鵝細小病毒HG5/82株的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2005,27(3):196-201.

[3] 霍峰,惠觀濤.應(yīng)用瓊脂擴散法檢測小鵝瘟抗原抗體[J].中國獸醫(yī)雜志,2000,26(2):21-22.

[4] Karsten Hueffer.Th e natu ral host range shift and sub sequent evolu tion of canin e parvovirus resulted from viru s-specific binding to the canine transfer in receptor[J].Journalof Virology,2003,2:1718-1726.