周玉龍,石忠鵬,耿 晶,陳永松,呂其林,劉 輝,張曉磊,吳 凌,樸范澤

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,黑龍江 大慶 163319;2.黑龍江省嫩江縣九三分局山河農(nóng)場獸醫(yī)院,黑龍江 嫩江 161421)

黑龍江省肇東市某豬場存欄生產(chǎn)母豬50頭,于2009年10月,同期生產(chǎn)的15頭母豬均出現(xiàn)產(chǎn)期滯后2～3 d,產(chǎn)死胎。母豬未見任何異常癥狀,而且死亡的胎兒也未見木乃伊化以及畸形等病理變化,但是剖檢時發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)胎兒心臟、脾臟、腎臟和膀胱黏膜等器官有散在的出血點。為了確診該豬群暴發(fā)流產(chǎn)的病因,我們進行了常規(guī)的細菌學檢驗,而且應用PCR方法對常見的能夠引起母豬發(fā)生流產(chǎn)的豬瘟病毒(CSFV)、呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)和細小病毒(PPV)進行了檢測,結果確診豬瘟病毒是引起本次發(fā)病的主要原因,關于繁殖障礙型豬瘟引起豬群發(fā)生全部以晚產(chǎn)為特征的病例報道極少,因此本研究對豬瘟的臨床診斷具有重要的借鑒意義,我們將有關試驗報告如下。

1 材料

1.1 主要試劑與培養(yǎng)基 T rizol(Invitrogen),AMV反轉錄酶和Taq DNA聚合酶(MBI),RNase Inhibitor、dN TP 和 DL-2000 Marker(TaKaRa)。按常規(guī)方法制備血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[1]。

表1 CSFV、PRRSV、PPV和PRV的PCR檢測引物

1.2 引物 參照已有的研究報道合成特異性的CSFV、PRRSV、PPV和PRV 寡核苷酸引物,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.3 病料 無菌采取發(fā)病母豬新流產(chǎn)的胎兒肝臟、脾臟、肺臟和淋巴結,置-70℃?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 細菌的分離鑒定 將無菌采集的流產(chǎn)胎兒肝臟、脾臟和肺臟分別接種到含有新鮮的5%綿羊血液營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,進行常規(guī)細菌分離培養(yǎng)(需氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng))[1]。

2.2 病毒檢測

2.2.1 CSFV和PRRSV檢測

2.2.1.1 組織總RNA提取 取約200 mg脾臟、肺臟和淋巴結分別在研缽中加入液氮研磨,按照1 m L T rizol/100 mg組織,按產(chǎn)品說明書進行RNA的提取,提取的RNA置核酸真空濃縮儀內(nèi)10 min,烘干后溶于30μL DEPC水中,放置-70℃待用。

2.2.1.2 cDNA合成與RT-PCR反應 模板RNA 10 μL,寡核苷酸 oligod T 1 μL,70℃5 min,置于冰上2 min,加入5×RT Buffer 4μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL,混勻瞬離,37℃ 5 min后加入 5U/μL AMV Reverse T ranscriptase 1μL 42℃2.5 h,70℃10 min放于冰上待用。

PCR反應體系(25μL):Buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0μL,25μm ol/m L引物 P1和P2各 0.5μL,5 U/μL LA Taq DNA 聚合酶 0.125 μL,無菌去離子水 16.9μL,模板 DNA 0.5μL。

PCR反應條件:94℃預變性5 min,進行30個循環(huán)(94 ℃30 s、50 ℃40 s、72 ℃1 min),72 ℃延伸10 min,最后降溫至4℃結束[2]。

2.2.2 PPV和PRV的檢測 按照常規(guī)方法從采集的病料肝臟、肺臟和淋巴結中提取組織DNA[4]。以提取的組織 DNA為模板,按照文獻報道進行PPV和PRV的雙重PCR擴增。反應體系為25 μL,反應程序為:94℃預變性10 min,進行30個循環(huán)(94 ℃40 s、55℃40 s、72 ℃1 min),72 ℃延伸10 min[3]。

3 結果

3.1 細菌分離結果 在需氧、厭氧和微需氧條件下,從流產(chǎn)胎兒的肝臟、脾臟和肺臟內(nèi)均未分離出細菌。

3.2 CSFV和PRRSV檢測結果 進行RT-PCR擴增后,PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中觀察,可見到288 bp的基因條帶,大小與CSFV預期基因相符(見圖1)。

3.3 PPV和PRV檢測結果 將PCR擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳,結果未見到目的基因條帶出現(xiàn)。

4 小結與討論

根據(jù)流行病學特點、臨床癥狀、剖檢病變,以及應用RT-PCR檢測到288 bp的CSFV基因片段,最終確診該豬群暴發(fā)的流產(chǎn)是由CSFV引起的。

圖1 RT-PCR擴增結果

近些年,關于豬群發(fā)生慢性豬瘟的報道越來越多,能夠引起慢性豬瘟的原因比較多,像豬瘟疫苗劑量應用不當及對豬瘟疫苗運輸、保存、注射操作、疫苗稀釋劑使用等方面的不規(guī)范,疫苗質量下降或失效;免疫抑制疫病干擾豬群,感染有藍耳病、圓環(huán)病毒病、偽狂犬病、喘氣病等疾病,或是使用了霉變劣質飼料,使機體免疫系統(tǒng)受到破壞,免疫力下降,即便使用豬瘟苗也難以起到完全保護作用[5];消毒防疫意識淡薄,豬群中有持續(xù)感染的帶毒母豬長期散毒,為豬瘟病毒繁殖與傳播提供了機會[6];不實行全進全出制度,對購入的豬苗的健康背景不明,易造成豬瘟交叉感染,同時發(fā)現(xiàn)病豬不及時隔離消毒,給豬瘟傳播提供便利。除了上述原因以外,另一個不容忽視的原因是豬瘟免疫程序不合理,免疫過頻時,體內(nèi)仍有高水平的抗體時就接種而發(fā)生中和,其次免疫密度過低,一般豬瘟疫苗接種必須半年1次[7]。該豬場是2006年建立,最初在母豬產(chǎn)后7 d接種豬瘟疫苗,自2009年起,免疫程序更改為母豬產(chǎn)后30 d接種豬瘟疫苗(與仔豬同期免疫),現(xiàn)在主要是更改免疫程序的母豬發(fā)生流產(chǎn),因此推斷該豬場發(fā)生慢性豬瘟流產(chǎn)的原因可能是更改免疫程序后造成免疫紊亂所致?？梢?對于豬瘟的預防應該在科學的抗體監(jiān)測基礎上,制定合理的免疫程序至關重要。

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