朱慶玲，黃海潮，葉娟，陳穎(廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣州市510520)

奧硝唑氯己定洗劑為廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院研制的新型復(fù)方制劑，用于細(xì)菌性陰道炎、滴蟲(chóng)性陰道炎和霉菌性陰道炎的治療。該制劑中奧硝唑是第3代硝咪唑類衍生物，與甲硝唑相比，是一種療效更高、療程更短、耐受性更好的強(qiáng)力抗厭氧菌藥物，其對(duì)于細(xì)菌性陰道炎、滴蟲(chóng)性陰道炎和霉菌性陰道炎的療效優(yōu)于甲硝唑及替硝唑[1，2]；處方中另一有效成分醋酸氯己定則是廣譜抗菌消毒藥[3]，具有較強(qiáng)的抗菌作用，2藥合用療效更為顯著；此外制劑處方中加有山梨酸鉀作為防腐劑。在研制過(guò)程中，筆者采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，發(fā)現(xiàn)奧硝唑、氯己定和山梨酸鉀的抑菌作用較強(qiáng)，不能消除其干擾，所以需要選擇合適的方法。經(jīng)查閱文獻(xiàn)[4]，發(fā)現(xiàn)這3種成分的水溶性較好，故認(rèn)為采用薄膜過(guò)濾法過(guò)濾時(shí)抑菌成分可通過(guò)濾膜[5]，而細(xì)菌被截留。決定根據(jù)0.22 μm濾膜可截留細(xì)菌的特性，選用薄膜過(guò)濾法來(lái)進(jìn)行本品種的微生物限度檢查。

根據(jù)《中國(guó)藥典》2005年版(二部)附錄ⅪJ微生物限度檢查法[4]，筆者對(duì)薄膜過(guò)濾法用于奧硝唑氯己定洗劑微生物限度檢查進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料

LX-B75L型高壓滅菌鍋(合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司)；LRH-150型恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；SHP-070型生化培養(yǎng)箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器廠)；HWS-24型恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司)；MSC-Advantage1.2生物安全柜(美國(guó)Thermo公司)；0.22 μm醋酸纖維素微孔濾膜(直徑:50 mm，上海新亞凈化器件廠)。

奧硝唑氯己定洗劑(自制，批號(hào):20090501，規(guī)格:醋酸氯己定1.2 mg·mL－1、奧硝唑0.2 mg·mL－1)；pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(自制，批號(hào):20090501)；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液(自制，批號(hào):20090501)。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基、改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

大腸埃希菌(ATCC8739)、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、銅綠假單胞菌(ATCC9027)、白色念珠菌(ATCC10231)、黑曲霉(ATCC16404)，均購(gòu)自廣東微生物菌種保藏中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌懸液制備

2.1.1 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌懸液。取3種菌的新鮮斜面培養(yǎng)物接種環(huán)置于10 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)18～24 h后取新鮮培養(yǎng)物1 mL加入9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－5～10－7，使成50～100 cfu·mL－1的菌懸液，備用。取白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物接種環(huán)至10 mL改良馬丁培養(yǎng)基中，經(jīng)25℃培養(yǎng)18～24 h后取新鮮培養(yǎng)物1 mL加入9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10－4～10－6，使為50～100 cfu·mL－1的菌懸液，備用。

2.1.2 黑曲霉懸液。取經(jīng)改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液l0 mL，將孢子洗脫，吸出孢子懸液，用墊有脫脂棉的漏斗(濕熱滅菌)過(guò)濾，除去菌絲，收集孢子懸液至另一無(wú)菌試管內(nèi)作為菌原液，取此孢子懸液1 mL加入9 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，稀釋至10－4～10－5，使成50～100 cfu·mL－1的孢子懸液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取本品10 mL至無(wú)菌錐形瓶中，加入滅菌后恒溫至45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL，采用少量分次加入，并在加入的同時(shí)晃動(dòng)錐形瓶，使供試品充分分散，充分振搖5 min，作為1∶10供試液。

2.3 微生物限度檢查方法驗(yàn)證

2.3.1 試驗(yàn)組。取1∶10供試液10 mL，各5份，分別置于45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中搖勻，在無(wú)菌操作下加入過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用45℃氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。其中3份在最后一次的沖洗液中分別加入1 mL大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌懸液(約50～100 cfu·mL－1)，過(guò)濾，將濾膜菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置35℃培養(yǎng)48 h后取出進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)；其余2份加入1 mL白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液(約50～100 cfu·mL－1)，同法過(guò)濾，將濾膜菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于25℃培養(yǎng)72 h取出計(jì)數(shù)。

2.3.2 菌液組。取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的菌液各1 mL(約50～100 cfu·mL－1)，注入平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置35℃培養(yǎng)48 h后取出做菌落計(jì)數(shù)。取白色念珠菌、黑曲霉的菌懸液各1 mL(約50～100 cfu·mL－1)，注入平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于25℃培養(yǎng)72 h取出計(jì)數(shù)。

2.3.3 供試品對(duì)照組。取1∶10供試液10 mL 2份，分別置于45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中搖勻，在無(wú)菌操作下加入過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用45℃的氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗3次，每次100 mL。其中1份濾膜菌面朝上貼于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，倒置35℃培養(yǎng)48 h后取出做菌落計(jì)數(shù)；另1份同法過(guò)濾，將濾膜菌面朝上貼于玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，倒置于25℃培養(yǎng)72 h取出計(jì)數(shù)，測(cè)量樣品本底菌數(shù)。

2.3.4 稀釋劑對(duì)照組。將供試液換成稀釋劑(氯化鈉-蛋白胨緩沖液)，平行操作2張濾膜，將濾膜菌面朝上貼于培養(yǎng)基上，同“2.3.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，考察稀釋劑對(duì)試驗(yàn)有無(wú)干擾。

“2.3.1～2.3.4”項(xiàng)試驗(yàn)每次平行做2個(gè)平皿并重復(fù)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。

分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)回收率，回收率的計(jì)算依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版附錄ⅪJ相關(guān)要求[4]，按照如下公式計(jì)算:

試驗(yàn)組的加菌回收率%＝(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)×100%

稀釋劑對(duì)照組的加菌回收率%＝稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)/菌液組平均菌落數(shù)×100%

本制劑的微生物限度檢查法回收率結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，各類試驗(yàn)菌的回收率均大于70%，本試驗(yàn)方法不受制劑中抑菌成分的影響，可用于對(duì)制劑中細(xì)菌、霉菌、酵母菌數(shù)的檢查。

2.4 控制菌檢查方法的驗(yàn)證

2.4.1 供試液的制備。同“2.2”項(xiàng)下1∶10供試液的制備。

2.4.2 試驗(yàn)組。取1∶10供試液10 mL，置于稀釋劑100 mL中搖勻，以無(wú)菌操作加入過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗3次，每次100 mL，然后取出濾膜，加入至100 mL增菌培養(yǎng)基中，然后加入1 mL控制菌(10～100 cfu·mL－1)，其中金黃色葡萄球菌加入至營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)液中，銅綠假單胞菌加入至膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液中，置于35℃下培養(yǎng)24 h。營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置于35℃下培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果；膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置于35℃溫度下培養(yǎng)48 h。均平行操作2個(gè)平皿，觀察結(jié)果。

表1 微生物限度檢查法回收率結(jié)果(n＝3)Tab 1Recovery results of microbial limit test(n＝3)

2.4.3 陰性菌對(duì)照組。取1∶10供試液10 mL，置于稀釋劑100 mL中搖勻，以無(wú)菌操作加入過(guò)濾器內(nèi)，減壓抽干后，用稀釋劑沖洗3次，每次100 mL，然后取出濾膜，加入到100 mL增菌培養(yǎng)基中，然后加入1 mL大腸埃希菌(10～100 cfu·mL－1)，置于35℃下培養(yǎng)24 h。營(yíng)養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)液劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，倒置于35℃下培養(yǎng)72 h觀察結(jié)果；膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板，倒置于35℃溫度下培養(yǎng)48 h。均平行操作2個(gè)平皿，觀察結(jié)果。

銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌控制菌方法驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌控制菌方法驗(yàn)證結(jié)果Tab 2Validation test result of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus

由表2可知，試驗(yàn)組檢出銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌，陰性菌對(duì)照組無(wú)生長(zhǎng)，說(shuō)明本試驗(yàn)方法適用于該制劑中銅綠假單胞菌與金黃色葡萄球菌的檢查。

3 討論

試驗(yàn)中所用的菌株必須為標(biāo)準(zhǔn)菌株，其生物學(xué)特性應(yīng)典型穩(wěn)定，且所用菌株的傳代不得超過(guò)5代；試驗(yàn)用的菌液最好存放在4℃下冷藏，在1個(gè)月內(nèi)使用。

奧硝唑氯己定洗劑中的主藥奧硝唑和氯己定抑制細(xì)菌能力很強(qiáng)，同時(shí)對(duì)酵母菌和真菌也有很強(qiáng)抑制作用，處方中還加有其它防腐劑導(dǎo)致對(duì)細(xì)菌也有抑制作用，但由于這3種成分在水中溶解度很好，故采用薄膜過(guò)濾法可將抑菌成分除去。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定時(shí)，試驗(yàn)中各類菌的回收率均大于70%；因其為外用制劑，故對(duì)銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行控制菌驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果陰性對(duì)照組均未檢出陰性對(duì)照菌，試驗(yàn)組檢出控制菌，可確定薄膜過(guò)濾法適用于奧硝唑氯己定洗劑的微生物限度檢查。

[1]盧巖，葛衛(wèi)紅，談恒山，等.復(fù)方奧硝唑凝膠的研制與質(zhì)量控制[J].中國(guó)藥房，2005，16(21):1630.

[2]王軍，王增壽，朱光輝，等.奧硝唑的臨床應(yīng)用及不良反應(yīng)[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25(7):711.

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政局編.中國(guó)醫(yī)院制劑規(guī)范[S].第2版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1995:38.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].2005年版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:附錄ⅪJ.

[5]王沁馨，周劍.雙黃連口服液微生物限度檢查法的驗(yàn)證[J].中國(guó)藥房，2008，19(27):2125.