蔡?hào)|向，池秀珍(1.福建晉江市醫(yī)院藥劑科，晉江市3600；.福建泉州市藥品檢驗(yàn)所，泉州市36000)

培美曲塞二鈉是抗腫瘤藥，在該原料藥的制備中使用了N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，其中二氯甲烷和DMF為第2類溶劑，限量分別為0.06%、0.088%，乙醇和丙酮為第3類溶劑，限量均為0.5%[1]。筆者在對(duì)該藥進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)二氯甲烷和丙酮在聚乙二醇-20M(PEG-20M)毛細(xì)管柱系統(tǒng)下難以分離，而在二甲基聚硅氧烷(DB-1)毛細(xì)管柱系統(tǒng)下丙酮與乙醇難以分離，考慮到各種溶劑的限量差異，故采用對(duì)4種溶劑兩兩分別分析測(cè)定的氣相色譜(GC)法檢測(cè)4種溶劑的殘留量，結(jié)果表明所建立的方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好。

1 儀器與試藥

GC-14B氣相色譜儀、氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)、N-2000色譜工作站(浙江大學(xué)信息工程研究所)。

培美曲塞二鈉原料藥(北京思普潤(rùn)安醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào):20041002、20041003、20041004，含量:98.92%、99.28%、99.06%)；二氯甲烷、DMF、四氫呋喃(THF)、無(wú)水乙醇、丙酮均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 二氯甲烷和DMF的檢查

2.1.1 色譜條件。色譜柱:DB-1石英毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm，1.0 μm)；柱溫:40℃；氣化室:180℃；檢測(cè)器:200℃；載氣:氮?dú)?N2):50 kpa，氫氣(H2):50 kpa，空氣:50 kpa；進(jìn)樣量:1 μL(不分流進(jìn)樣)；溶劑為水。

在上述色譜條件下，取“2.1.2”項(xiàng)下二氯甲烷、DMF和內(nèi)標(biāo)THF的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，記錄色譜，理論板數(shù)按二氯甲烷計(jì)不得低于4000，二氯甲烷、DMF及THF兩兩之間的分離度應(yīng)大于1.0。色譜見(jiàn)圖1A。

2.1.2 溶液的制備。(1)標(biāo)準(zhǔn)貯備液:分別精密稱取二氯甲烷60 mg、DMF 88 mg置于同一100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(2)內(nèi)標(biāo)溶液:精密稱取THF 75 mg置于100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(3)對(duì)照品溶液:精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液及內(nèi)標(biāo)溶液各1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(4)供試品溶液a:精密稱取1 g的樣品，置于10 mL容量瓶中加水溶解，加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加水定容至刻度，搖勻，即得。

取供試品溶液a進(jìn)樣，色譜見(jiàn)圖1B。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，每瓶中加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加水定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液1 μL進(jìn)樣(每點(diǎn)3次)，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，以待測(cè)溶劑與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行回歸，計(jì)算線性方程，得二氯甲烷的回歸方程為Y＝0.0166X－0.0911(r＝0.9988)；DMF的回歸方程為Y＝0.0334X－0.1669(r＝0.9997)。結(jié)果表明，二氯甲烷、DMF的檢測(cè)濃度線性范圍分別為11.4～171、14.76～221.4 μg·mL－1。

2.1.4 檢測(cè)限。取標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋10倍，調(diào)整進(jìn)樣量至響應(yīng)信號(hào)峰高為基線的3倍，即為檢測(cè)限。測(cè)得二氯甲烷和DMF的檢測(cè)限分別為0.30、0.02 ng。

2.1.5 精密度試驗(yàn)。取“2.1.3”項(xiàng)下的第3號(hào)溶液，精密吸取1 μL，分別進(jìn)樣5次，記錄峰面積，以峰面積比值計(jì)算日內(nèi)精密度，結(jié)果二氯甲烷、DMF的RSD分別為1.4%、1.9%；另取該溶液分別于3 d內(nèi)進(jìn)樣，以峰面積比值計(jì)算日間精密度，結(jié)果RSD分別為1.7%、2.2%。

2.1.6 回收率試驗(yàn)。取已知?dú)埩袅康臉悠? g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加水適量溶解，精密加入標(biāo)準(zhǔn)貯備液及內(nèi)標(biāo)溶液各1.00 mL，加水定容至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別取樣品溶液及“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，以峰面積按內(nèi)標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)Tab 1Results of recovery test(n＝3)

2.1.7 樣品中二氯甲烷和DMF的殘留量測(cè)定。精密稱取1 g的樣品，置于10 mL容量瓶中加蒸餾水溶解，加1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加水定容至刻度。精密吸取1 μL進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果二氯甲烷和DMF均未檢出，說(shuō)明樣品符合要求。

2.2 丙酮和乙醇的檢查

2.2.1 色譜條件。色譜柱:PEG-20M石英毛細(xì)管柱(30 m×0.53 mm，1.0 μm)；柱溫:42℃；氣化室:180℃；檢測(cè)器:200℃；恒溫載氣:N2:50 kpa，氫氣:50 kpa，空氣:50 kpa；進(jìn)樣量:1 μL(不分流進(jìn)樣)；溶劑為水。

在上述色譜條件下，取“2.2.2”項(xiàng)下乙醇與丙酮的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，各組分色譜峰的理論板數(shù)均不得低于3000，二者分離度應(yīng)大于2.0，色譜見(jiàn)圖1C。

2.2.2 溶液的制備。(1)標(biāo)準(zhǔn)貯備液:精密稱取丙酮和乙醇各0.1 g置于同一100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(2)對(duì)照品溶液:精密量取標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得。(3)供試品溶液b:取樣品，精密稱取1 g置于10 mL容量瓶中，以水稀釋至刻度，搖勻，即得。

取供試品溶液b進(jìn)樣分析，色譜見(jiàn)圖1D。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。精密量取0.2、0.5、1、2、3 mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別吸取上述溶液1 μL進(jìn)樣(3次)分析，記錄峰面積，以各濃度點(diǎn)峰面積平均值(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行回歸，得乙醇的回歸方程為Y＝701.77X+1562.6(r＝0.9996)，丙酮的回歸方程為Y＝677.46X－997.3(r＝0.9990)。結(jié)果表明，乙醇與丙酮的檢測(cè)濃度線性范圍均為20～300 μg·mL－1。

2.2.4 檢測(cè)限。取標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液用水稀釋50倍進(jìn)樣，調(diào)整進(jìn)樣量至響應(yīng)信號(hào)峰高為基線的3倍即為檢測(cè)限。按此方法測(cè)得乙醇和丙酮的檢測(cè)限分別為0.09、0.02 ng。

2.2.5 精密度試驗(yàn)。取“2.2.3”項(xiàng)下第3號(hào)溶液，精密吸取1 μL，分別進(jìn)樣5次，記錄峰面積，以峰面積計(jì)算日內(nèi)精密度，結(jié)果乙醇和丙酮的RSD分別為0.4%、1.6%；另取該溶液分別于3 d內(nèi)進(jìn)樣，以峰面積計(jì)算日間精密度，結(jié)果分別為0.9%、1.2%。

2.2.6 回收率試驗(yàn)。取已知?dú)埩袅康臉悠? g，精密稱定，置于10 mL容量瓶中，加水適量溶解，精密加入標(biāo)準(zhǔn)貯備液1.00 mL，加水定容至刻度，搖勻，得樣品溶液。分別取樣品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.7 樣品中乙醇和丙酮?dú)埩袅繙y(cè)定。分別精密吸取1 μL供試品溶液和對(duì)照品溶液進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果乙醇和丙酮均未檢出。

3 討論

本品在合成過(guò)程中所用的4種有機(jī)溶劑在測(cè)定時(shí)，由于柱長(zhǎng)有限，因而互相之間易產(chǎn)生干擾，如以SE-30(甲基硅橡膠)為固定液，則乙醇和丙酮不易分開(kāi)；而以PEG-20M為固定液，則二氯甲烷與乙醇互相干擾。但分別測(cè)定時(shí)，則干擾可消除?？紤]到DMF在PEG-20M柱上出峰較晚，故測(cè)定樣品時(shí)采用程序升溫(42℃保持3 min后，以15℃·min－1升至140℃并保持3 min)，以保證DMF完全流出色譜柱。同時(shí)該色譜體系下的測(cè)定結(jié)果也表明，在SE-30體系中保留時(shí)間5.5 min處的峰為溶劑峰，而不是樣品中的DMF殘留。結(jié)果，樣品中4種溶劑未檢出。

人用藥品注冊(cè)技術(shù)規(guī)范國(guó)際協(xié)調(diào)在關(guān)于有機(jī)溶劑殘留量的指導(dǎo)原則中將二氯甲烷、DMF列為第2類必須控制的毒性試劑，將乙醇、丙酮列為第3類低毒性的溶劑[2]。根據(jù)《化學(xué)藥物殘留溶劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[3]，本品在水中易溶，同時(shí)殘留的有機(jī)溶劑也能在水中溶解，所以采用水作為溶劑進(jìn)行試驗(yàn)。本試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定有機(jī)溶劑的含量，可減少儀器系統(tǒng)或操作過(guò)程的誤差。經(jīng)對(duì)多種有機(jī)溶劑的篩選，選擇THF為內(nèi)標(biāo)可與4種有機(jī)溶劑達(dá)到基線分離，無(wú)干擾，方法學(xué)試驗(yàn)得到滿意結(jié)果，精密度也符合2010年版《中國(guó)藥典》[1]的要求(RSD＜5%)。故該法可用于測(cè)定培美曲塞二鈉原料藥中有機(jī)溶劑的殘留量，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可信。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國(guó)藥典(二部)[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄61～65、194.

[2]周海均主譯.藥品注冊(cè)的國(guó)際技術(shù)要求·質(zhì)量部分[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2000:79.

[3]國(guó)家藥品審評(píng)中心.化學(xué)藥物殘留溶劑研究的技術(shù)指導(dǎo)原則[Z].2005.