劉克武,于洋

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所,黑龍江省非木質林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室,牡丹江 157011;2.北京林業(yè)大學材料科學與技術學院)

刺五加(Acanthopanacis senticosl)為五加科落葉灌木,其根、莖和葉具有較高的藥用價值,具有調節(jié)血壓,安神補腦,抗輻射,抗疲勞,增強免疫力的功效。不同種源和不同品種刺五加的有效成分差異很大,通過遺傳改良可明顯提高刺五加藥用價值。傳統(tǒng)的選育方法主要是根據(jù)樹皮顏色及形狀、枝形、葉形、果實產(chǎn)量等形態(tài)性狀進行選擇。但形態(tài)性狀數(shù)量有限、多態(tài)性差、易受環(huán)境影響,選擇效率低下。近年來,分子標記技術的發(fā)展和應用,為人們提高植物育種效率帶來了希望。分子標記技術是建立在DNA序列多態(tài)性基礎之上的,是基因型的直接反映。以分子標記為基礎的分子標記輔助選擇具有傳統(tǒng)育種無可比擬的優(yōu)越性,即傳統(tǒng)育種從表現(xiàn)型推斷基因型,而分子標記輔助選擇可對基因型進行直接選擇。AFLP(Amplified Fragment Length Ploymorphsim)標記技術是在RFLP技術和RAPD技術的基礎上發(fā)展起來的一種高效分子標記[1]。該方法結合了RFLP和RAPD的特點,既具有RFLP可靠性好、重復性高的優(yōu)點,同時又具有PCR的高效性、安全性和方便性的優(yōu)點,適合所有生物基因組的檢測,因此被認為是迄今為止最有效、最理想的一種DNA分子標記技術[2-5]。特別是在對生物遺傳背景不甚了解的情況下,AFLP標記技術更可以顯示出高效性和穩(wěn)定性的特點。因此,AFLP分子標記被廣泛用于生物遺傳研究,如遺傳連鎖圖譜的構建,目的基因的定位、品種鑒別、分類和系統(tǒng)發(fā)育研究等多個方面。本研究以來自不同種源的刺五加為材料,通過對AFLP反應體系各關鍵影響因素進行優(yōu)化,建立適于刺五加的AFLP反應體系,為刺五加遺傳圖譜的構建和分子標記輔助選擇育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

刺五加葉片來自6個種源,分別來自黑龍江省的牡丹江、虎林、綏棱、伊春和吉林省吉林和延邊。每個種源的10個單株的等量葉片混合為測試樣本。

1.2 DNA提取

第一種方法,按照 Rogers和Bendich(1988年報道)CTAB法(Cetyl triethyla mmonium bromide)[6]并略加改進后的程序進行,具體步驟如下:①取0.2g超低溫保鮮的葉片,加液氮研磨,然后轉入到1.5 m L離心管中,保存于-20℃冰箱中;②加入0.5m L 56℃的2×CT AB(2%CTAB 100mm T ris 20mm EDTA 1%PVP 1.4MNaCl)混勻并在56℃水浴中保溫 5min;③加入0.2 m L 24︰1的氯仿異戌醇后,繼續(xù)在56℃水浴中保溫5min,然后振蕩30min;④8000g離心10min,然后取上清液于另一離心管中;⑤在原離心管中再加入0.5m L 56℃1×CTAB(1%CTAB 50mmTris 10mm EDTA 0.5%PVP 0.7MNaC l)混勻,并在56℃水溶中靜止保溫5min,然后振蕩15min;⑥再取上清液并與第一次取的上清液放入同一離心管中;⑦加入0.5m L異丙醇沉淀,然后用70%的乙醇清洗,風干后溶于TE中。

第二種方法,針對刺五加葉片組織富含酚類和糖類物質,基因組DNA較難提純的特點。本研究采取了CTAB法試劑盒相結合的DNA分離方法(改良的試劑盒法),即先將研磨碎的葉片用 2×CTAB(2%CTAB 100mm Tris 20mm EDTA 1%PVP 1.4MNaCl)高鹽溶液洗滌,去除多糖,然后利用 Universalgenomic DNA extraction kit(Ver.3.0,Takara,Dalian)試劑盒提取DNA。

1.3 AFLP分析

利用模板準備試劑盒(Template Preparetion Kit,LincoIn,Nebraka,USA)準備預擴增模板:酶切反應體積為12.5μL,含基因組DNA 100 ng,限制性內(nèi)切酶EcoRI和MseI各1.25單位,在37℃條件下消化2 h;75℃加熱15 min后轉移至冰上,加入25μL接頭和T 4 DNA連接酶混合液,20℃保溫連接2 h;用具有一個選擇性堿基的引物對連接產(chǎn)物進行預擴增。預擴增程序為:為 94℃變性30s,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,20循環(huán)。選擇性擴增用AFLP選擇擴增試劑盒(AFLP Selective Amplification Kit,LincoIn,Nebraka,USA)進行。以稀釋10～20倍的預擴增產(chǎn)物為模板,用700 nm紅外染料標記的含3個選擇性堿基的選擇性擴增引物進行選擇性擴增。擴增程序為:第一次循環(huán)為94℃變性30 s,65℃退火30s,72℃延伸1min,隨后每次循環(huán)退火溫度降低0.7℃共12個循環(huán);接下來繼續(xù)23個循環(huán):94℃變性30 s,56℃退火30s,72℃延伸 1min,72℃延伸 7min。預、選擇性擴增均在ABI9700型PCR儀上進行。選擇性擴增產(chǎn)物加入2.5μL的凝膠加樣緩沖液混勻,94℃變性3min,然后迅速置于冰上,取1μL,用7%的標準測序膠,凝膠電泳及數(shù)據(jù)分析在LI-COR 4300 DNA分析系統(tǒng)儀器上進行。電泳結束后圖像信息自動保存在或讀取多態(tài)性數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 刺五加基因組DNA提取方法的優(yōu)化

圖1 刺五加葉片基因組DNA的提取

圖2 刺五加葉片基因組DNA的PCR擴增

刺五加葉片富含酚類和糖類物質,基因組DNA較難提純;AFLP標記技術對DNA質量要求也很高。本研究首先采取了CTAB法分離刺五加DNA,結果發(fā)現(xiàn)此種方法去除多糖不夠徹底(圖1),嚴重影響了DNA的酶切效果(數(shù)據(jù)未列出)。為提高DNA質量,本研究對刺五加DNA的提取方法進行了改良,采用CTAB法與DNA提取試劑盒相結合的方法提取DNA,結果表明,用改良的方法提取的刺五加基因組DNA的質量明顯提高。從電泳圖片(圖1)可以看出DNA條帶清楚,沒有彌散現(xiàn)象發(fā)生,RNA去除比較干凈,未發(fā)現(xiàn)有多糖等雜質存在。以改良后的DNA提取方法提取的DNA為摸板,用一個隨機引物5'-ACAGCCTGCT-3'進行PCR擴增,結果表明PCR擴增效果良好(圖2),說明該方法提取的DNA比較完整、純度高無雜質,能滿足有關酶切和PCR擴增實驗的要求。

2.2 引物的擴增效果

用8個Eco RI引物和8個MseI引物組成的64對引物對來自牡丹江種源的刺五加進行擴增,結果表明,所有引物對均可擴增出中清晰可見的產(chǎn)物。其擴增產(chǎn)物的分布范圍在80～500 bp之間,而主要分布在110～450 bp之間。圖3是引物組合M-CAA/E-ACC、MCTG/E-ACA 、M-CAC/E-ACA 、M-CAC/E-AAG 、MCTG/E-AGC在牡丹江種源的刺五加中擴增情況。不同引物對的擴增效果存在很大差異,M-CAA/E-ACC擴增位點最豐富,擴增出54個位點;引物組合MCTA/E-AGG和M-CTC/E-AAC擴增效果最差,擴增出9個位點,64對引物平均擴增位點32個。不同引物組合擴增的多態(tài)性位點數(shù)差異很大,以引物同E-ACA或M-CTG組合的擴增效果最好,這2個引物產(chǎn)生的多態(tài)性位點分別是23個和21個;而以E-AGC或E-ACG組合的擴增效果較差與之組合的M-CTG/E-ACG和M-CTC/E-AGG多態(tài)性效最低,僅5個?？梢姴煌锝M合的擴增效果相差非常大,進行引物組合的篩選非常重要。選用圖3中所用的5對引物組合在6個刺五加種源中共擴增出89個多態(tài)位點。這些多態(tài)性分子標記為進一步研究刺五加不同種源間的遺傳差異和進行分子標記輔助選擇奠定了基礎。

圖3 刺五加AFLP分子標記分析

3 討論

AFLP技術多態(tài)性豐富、靈敏度高、DNA用量少,但對DNA的純度要求較高。許多木本植物,特別是刺五加的莖葉組織含有大量的多糖、多酚及其它次生代謝產(chǎn)物,用CTAB等常規(guī)方法或DNA提取試劑盒獲得的DNA往往含有較多的多糖成分,使得DNA埋在多糖的粘稠膠狀物中而難以溶解,嚴重影響了DNA的酶切效果和PCR效果。能否提取出高純度DNA是制約刺五加分子標記遺傳圖譜的構建和分子標記輔助育種的研究進程重要因素之一。本研究為克服刺五加葉片次生代謝物多,影響DNA提取質量的問題,采用高鹽CTAB去糖與試劑盒粘膜技術相結合方法。結果表明,利用該方法得到的刺五加基因組DNA質量明顯提高,能夠滿足類似AFLP的要求。目前,根據(jù)AFLP標記因顯色方法不同,分為同位素標記、硝酸銀染色和熒光染料標記等3種方法。同位素標記和硝酸銀染色方法,易造成環(huán)境污染和耗費時間長等缺點。利用紅外熒光檢測技術分析,通過Li-Cor4300DNA系統(tǒng)分析AFLP標記,可直接讀取多態(tài)性條帶,節(jié)省了染色或暴光等步驟,減少了射性污染和銀離子污染。同時,由于靈敏度高使得獲得的DNA指紋與相應的放射自顯影和銀染相比具有更強的可重復性。

[1]Fang DQ,Roosem L.Indentification of closely related citrus cultivars w ith intersimple sequence repeat markers[J].Theor Appl Genet,1997,95:468-471.

[2]Vos P,Hogers R,Bleeker M,Reijans M,van de Lee T,Hornes M,Frijters A,Pot J,Peleman J,Kuiper M,Zabeau M.AFLP:A new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acid Research,1995,23(21):4407-4414.

[3]王斌,翁曼麗.AFLP的原理及其應用[J].雜交水稻,1996(5):27-39.

[4]Mueller UG,Wolfenbarger LL.AFLP genotyping and fingerprinting[J].Trends Ecol Evol,1999,14(10):389-394.

[5]Morgante M,Olivieri AM.PCR amplified microsatellities as makers in plant genetics[J].The Plant,1993,3(1):175-176.

[6]Rogers SO,Bendich AJ.Extraction of DNA from plant tissues.In:Gelvin SB,Schilperoort RA(eds)Plant Molecular Biology Manual,A 6:l-10.Boston,MA:1988,Kluwer Academic Publishers.