陳兆國，米榮升，于慧珠，郝言明，胡義彬，黃 燕，李正鋒，李 艷，林矯矯

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室/上海動物生物技術(shù)研究中心，上海200241)

雞球蟲病是由艾美耳屬(Eimeria)球蟲引起的一種寄生蟲病，嚴重危害雞的生長發(fā)育，對雛雞的危害尤為嚴重。雞球蟲分為：堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)、布氏艾美耳球蟲(E.brunetti)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)、和緩艾美耳球蟲(E.mitis)、毒害艾美耳球蟲(E.necatrix)、早熟艾美耳球蟲(E.praecox)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)7種。其中E.praecox是一種“早熟型”球蟲，卵囊相對較大，最短孢子化時間為12 h，最短潛在期為83 h。由于該蟲種對雞的致病性較弱，因而對其研究較少。由于雞球蟲病多為球蟲混合感染引起，并且感染率高，對養(yǎng)雞業(yè)造成的損失巨大，因此愈來愈受到人們的關(guān)注。

本研究對上海田間球蟲混合樣品進行分離和鑒定，為豐富我國雞球蟲蟲種資源，發(fā)展球蟲病防治技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 球蟲樣品和實驗動物 含E.praecox卵囊的多個艾美耳球蟲蟲種，分離自上海郊區(qū)某雞場，經(jīng)雞傳代后收集卵囊，孢子化后4℃保存?zhèn)溆?；黃羽肉雞購自上海郊區(qū)某大型雞場。

1.2 菌株和載體E.coliDH5α由本實驗室保存；pMD18-T載體購自TaKaRa公司。

1.3 主要試劑 TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0、ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ均購自TaKaRa公司；DNA膠回收試劑盒購自愛思進生物技術(shù)有限公司；100 bp DNA Ladder購自北京天根生化科技有限公司。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)Schnitzler等報道設(shè)計雞球蟲蟲種鑒定引物[4-5](表1)。根據(jù)Barta等報道設(shè)計雞球蟲18S rRNA鑒定引物[6]，上游引物ERIB1：5'-ACC TGGTTGATCCTGCCAG-3'，下游引物ERIB10：5'-C TTCCGCAGGTTCACCTACGG-3'。由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成。

表1 雞球蟲蟲種鑒定引物Table 1 Primers used forEimeriaspecies identification

1.5E.preacox單一蟲株的分離

1.5.1 預(yù)分離 收集、純化球蟲樣品，經(jīng)嗉囊感染14日齡黃羽肉雞10羽，每羽感染5×104個孢子化卵囊。感染后80 h～92 h收集糞便，按常規(guī)方法收集卵囊，加入2.5%重鉻酸鉀水溶液，培養(yǎng)至孢子化卵囊達80%以上，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 單卵囊分離 按文獻[7]方法感染單卵囊，共感染雛雞15羽。感染后5 d(DPI)開始逐只檢查雞糞中是否含有球蟲卵囊，7DPI剖殺陽性雞，取小腸前1/3部分內(nèi)容物鏡下觀察，收集卵囊，28℃培養(yǎng)至孢子化。

1.6 生物學(xué)性狀檢測 取1.5.2培養(yǎng)的孢子化卵囊，感染無球蟲雛雞，從感染后76 h起，每小時收集糞便并檢查是否有卵囊排出，至發(fā)現(xiàn)卵囊止；7DPI剖殺，檢查腸道卵囊寄生部位；收集腸道卵囊進行孢子化培養(yǎng)，觀察最短孢子化時間；觀察孢子化和未孢子化卵囊的形態(tài)。

1.7 單一蟲株的蟲種鑒定

1.7.1 蟲種的初步確定 根據(jù)卵囊形態(tài)大小、最短潛在期、寄生部位和最短孢子化時間等結(jié)果，參考文獻，初步確定蟲種。

1.7.2 蟲種PCR鑒定 取105個經(jīng)飽和鹽水漂浮法純化的孢子化卵囊，勻漿破碎，按TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0試劑盒說明書操作提取蟲體基因組DNA。以基因組DNA為模板，用表1中7對引物分別進行PCR擴增。反應(yīng)條件：95℃2 min；95℃30 s、62℃30 s、72℃1 min，30個循環(huán)；72℃10 min。

1.8 18S rRNA基因的擴增和序列測定

1.8.1 PCR擴增 以基因組DNA為模板，應(yīng)用18S rRNA引物進行PCR擴增。反應(yīng)條件：94℃5min；94℃ 30 s、57℃ 30 s、72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.8.2 擴增片段的克隆及篩選 應(yīng)用V-gene DNA凝膠回收試劑盒對擴增片段進行回收并純化，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α中，采用藍白斑篩選陽性菌落，提取重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和酶切鑒定，篩選陽性克隆。

1.8.3 序列測定和分析 陽性重組質(zhì)粒由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。利用DNAStar及Mega 4.0軟件進行序列比對和分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.9 單一蟲株的致病性觀察 選取1個單一蟲株進行致病性試驗。將體質(zhì)量相近的14日齡雛雞60羽，平均分為 6組，經(jīng)嗉囊接種 0、1×104、5×104、1×105、2×105、4×105個孢子化卵囊。7DPI稱重、剖殺，觀察各組實驗雞的增重、飼料轉(zhuǎn)化率和腸道病變。

1.10 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 12.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 單卵囊分離結(jié)果 對糞便和小腸內(nèi)容物進行檢查，單卵囊接種的15羽雛雞中，有5羽感染，單卵囊接種感染率為33.3%。收集編號為EPSH的單一蟲株的卵囊進行重新接種、蟲種鑒定和生物學(xué)性狀測定。

2.2 EPSH的生物學(xué)性狀測定

2.2.1 卵囊形態(tài) 卵囊多數(shù)呈橢圓形，少數(shù)呈卵圓形或球形，壁光滑，無卵膜孔；經(jīng)孢子化的卵囊內(nèi)有一極粒，無卵囊殘體，無孢子囊殘體。

隨機測定從腸道、糞便收集的未孢子化和孢子化卵囊各 50個，大小為 15.00 μm～25.00 μm×13.75 μm～22.5 μm，平均大小為 20.07 μm×17.52 μm，形狀指數(shù)(shape index，SI)為1.15，具體見表2。

表2 ETSH株球蟲卵囊大小Table 2 Oocysts size of ETSH

最小顯著差數(shù)法(Least-significant difference，LSD)檢驗分析顯示，收集于腸道的EPSH株孢子化卵囊與未孢子化卵囊長和寬的顯著性(Sig)分別為0.137和0.071，p>0.05，無顯著差異；但收集于腸道的卵囊與收集于糞便的卵囊比較，Sig均為0，p<0.01，差異極顯著；收集于糞便的未孢子化卵囊分別與孢子化卵囊的長和寬比較，其中長度的Sig為 0.020，p<0.05，差異顯著；寬度的 Sig為 0，p<0.01，差異極顯著(表 2)。用 Studednt-Newman-Keuls和Duncan法檢驗，結(jié)果與LSD法一致。

2.2.2 寄生部位 EPSH株寄生于小腸前1/3部位，主要寄生于十二指腸。

2.2.3 最短孢子化時間 經(jīng)2次以上重復(fù)檢查，結(jié)果顯示EPSH株腸道收集到卵囊的最短孢子化時間為16 h。

2.2.4 最短潛在期 將收集的卵囊接種無球蟲雛雞，觀察結(jié)果顯示最短潛在期為81 h。

2.3 蟲種PCR鑒定 EPSH株卵囊基因組DNA經(jīng)7對引物分別擴增后，僅引物EPA/EPR擴增出約400 bp的片段(圖1)，表明該蟲株為E.praecox，命名為E.praecox上海株。

2.4 18S rRNA基因的克隆和系統(tǒng)發(fā)生分析 ETSH株球蟲18S rRNA基因擴增片段大小約為1 700 bp。將PCR產(chǎn)物連接于pMD18-T載體中，PCR及酶切鑒定結(jié)果均正確。序列測定結(jié)果表明EPSH株18S rRNA基因序列長1 747 bp，與GenBank登錄的E.praecox18S rRNA基因序列(U67120)同源性為 99.4%(表3)。與E.acervulina、E.brunetti、E.maxima、E.mitis、E.necatrix和E.tenella18S rRNA序列(登錄號分別為 U67115、U67116、U67117、U67118、U67119 和U67121)同源性分別為97.7%、96.4%、96.7%、94.5%、95.0%和95.5%。已將該序列錄入Gen-Bank，登錄號為GQ421692。

系統(tǒng)進化樹分析顯示上海田間分離的EPSH株與GenBank登陸的E.praecox在同一個分支上，與E.mitis、E.brunetti和E.maxima的遺傳距離相對較近，但E.acervulina、E.necatrix和E.tenella的遺傳距離相對較遠(圖2)。

2.5 致病性 以不同劑量的EPSH株球蟲接種雛雞，均未死亡。但隨著接種劑量的增加，雛雞相對增重率逐漸下降，而料肉比呈逐漸上升趨勢(表3)。感染雞病變僅局限于十二指腸，主要表現(xiàn)為腸管壁有少量粘液，并有針尖狀出血點，而空腸未見眼觀病變。其中 1×104、5×104、1×105、2×105和 4×105劑量接種組分別有4羽、4羽、5羽、6羽和5羽出現(xiàn)上述癥狀。

從排卵囊情況分析，各組均在4 DPI開始排出卵囊，其中1×104感染組在5 DPI達到排卵囊峰值，此后逐漸下降。其余4組均在6 DPI達到排卵囊峰值，7 DPI則明顯下降(圖3)。

表3 ETSH株球蟲卵囊大小Table 3 Oocysts size of ETSH

3 討 論

本研究利用單卵囊分離技術(shù)從上海田間混合樣品中分離獲得5個雞艾美耳球蟲單一純化株，通過卵囊形態(tài)大小、最短孢子化時間、最短潛在期和寄生部位等生物學(xué)特性觀察及PCR鑒定，確定編號為EPSH的單一蟲株為E.praecox，命名為E.praecox上海株。

卵囊的量度可以作為球蟲的一種特征，但不同的研究者報道的E.praecox也存在細微的差異，而且多為孢子化卵囊的報道，其中，Johnson和Gore等報道卵囊的平均大小為 23.00 μm～23.80 μm×19.50 μm～20.6 μm，SI為 1.16～1.17[1,8]；Tyzzer和Edgar等報道卵囊的平均大小為21.25 μm～21.30 μm×17.07 μm～17.10 μm，SI為 1.24～1.25[1,9]；Long和Jorgensen等報道卵囊的平均大小為20.40 μm～20.60 μm×16.94 μm～17.10 μm，SI為 1.19～1.25[10,11]；徐衛(wèi)東等分離的E.praecox長春株大小為19.43 μm×15.98 μm，SI為 1.11～1.38，平均為 1.22[2]。而未孢子化卵囊的大小報道較少。本研究證實不同來源的E.praecox卵囊大小存在差異，收集自腸道的卵囊明顯小于收集自糞便的卵囊；收集自糞便的未孢子化卵囊與孢子化卵囊的大小也有明顯差異。造成這種現(xiàn)象的原因目前尚不清楚，推測可能與卵囊所處環(huán)境有關(guān)，在腸道內(nèi)，受宿主內(nèi)環(huán)境包括溫度、濕度、酸堿度和壓力等理化因素、蛋白酶等生物因素的影響，使卵囊處于相對收縮狀態(tài)；排出體外后，上述因素相對減輕或發(fā)生變化，卵囊也處于相對舒展的狀態(tài)，具體原因需要進一步研究。

關(guān)于E.praecox的最短潛在期，文獻報道多為83 h～84 h[1,8-10,12]，而Jorgensen等報道為92 h[11]，徐衛(wèi)東等報道為89 h[2]。本研究分離的E.praecox的最短潛在期僅為81 h，比上述報道至少提前2 h，其原因尚不清楚，推測可能是特定地理環(huán)境造成的。而蟲株最短孢子化時間為16 h，比Edgar等的報道晚4 h[9]，早于徐衛(wèi)東等報道的20 h[2]和Norton報道的21 h[13]，這可能與培養(yǎng)溫度、重鉻酸鉀溶液的添加量和雜質(zhì)數(shù)量等因素有關(guān)。但其最短孢子化時間仍比除E.mitis(15 h)外的其他雞球蟲的時間要短[14]。孢子化速度通常被引證為球蟲種的特征，在相同條件下，作為一個特征對兩種球蟲卵囊的比較，結(jié)果是比較可信的，但測量方法應(yīng)盡量標準。

關(guān)于E.pracecox的致病性，文獻報道較少。本研究顯示，E.pracecox上海株感染雛雞后，部分雛雞腸道出現(xiàn)少量粘液，并有針尖狀出血點，但病變位置僅在十二指腸。隨著感染劑量的增加，出現(xiàn)病變的雛雞數(shù)相應(yīng)增加，雞只的相對增重逐漸下降，而飼料轉(zhuǎn)化率則呈遞增趨勢，表明雛雞的病變情況與E.pracecox的感染劑量呈正相關(guān)，對增重及飼料轉(zhuǎn)化率有較大的影響，同時影響?zhàn)B雞業(yè)的經(jīng)濟效益，應(yīng)該引起重視。

[1]Tyzzer E E,Theiler H,Jones E E.Coccidiosis in gallinaceous birds.Ⅱ.A comparatire study of species ofEimeriaof the chicken[J].Am J Hyg,1932,15:319-393.

[2]徐衛(wèi)東，王亮，孫維東.早熟艾美耳球蟲地方株的分離與鑒定[J].吉林畜牧獸醫(yī)，1995，(4)：10-13.

[3]Chapman H D.The treatment of coccidiosis:studies on the sensitivity of recent field isolates ofEimeria acervulinatype to anticoccidial drugs given in the drinking water[J].J Comparat Pathol,1982,92:213-218.

[4]Schnitzler B E,Thebo P L,Mattsson J G,et al.Development of a diagnostic PCR assay for the detection and discrimination of four pathogenicEimeriaspecies of the chicken [J].Avian Pathol,1998,27(5):490-497.

[5]Schnitzler B E,Thebo P L,Tomley F M,et al.PCR identification of chickenEimeria:a simplified read-out[J].Avian Pathol，1999,28(1):89-93.

[6]Barta J R,Martin D S,Liberator P A,et al.Phylogenetic relationships among eightEimeriaspecies infecting domestic fowl inferred using complete small subunit ribosomal DNA sequences[J].J Parasitol,1997,83(2):262-271.

[7]黃兵，吳薛忠，史天衛(wèi)，等.毒害艾美球蟲純種分離的初步鑒定和致病性研究[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，1993，1(4)：24-28.

[8]Gore T C,Long P L.The biology and pathogenicity of a recent field isolate ofEimeria praecoxJohnson,1930[J].J Protozool,1982,29(1):82-85.

[9]Edgar S A,Seibold C T.A new coccidium of chickens,Eimeria mivatisp.n.(Protozoa:Eimeriidae)with details of its life history[J].J Parasitol,1964,50(2):193-204.

[10]Long P L.Studies onEimeria praecoxJohnson,1930,in chicken[J].Parasitology,1967,57:351-361.

[11]Jorgensen W K,Stewart N P,Jeston P J,et al.Isolation and pathogenicity of Australian strains ofEimeria praecoxandEimeria mitis[J].Aust Vet J，1997，75(8):592-595.

[12]Salisch H.A study of the life cycle ofEimeria praecox,Johnson 1930[J].Zentralbl Veterinarmed B,1990,37(5):363-368.

[13]Norton C C,Chard M J.The oocyst sporulation time ofEimeriaspecies from the fowl[J].Parasitology,1983,86(2):193-198.

[14]索勛，李國清.雞球蟲病學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998.