鞠厚斌，曹火仁，張維誼，劉 健，周錦萍

(1.上海市動物疫病預防控制中心，上海201103；2.上海市松江區(qū)動物疫病預防控制中心，上海201611)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起禽類的一種高度接觸性、急性敗血性傳染病，多見于雞和珍珠雞，也能感染其他家禽和野禽[1]。該病廣泛存在于世界各地，特別是強毒株可導致嚴重的內臟器官的損傷和神經(jīng)系統(tǒng)疾病，死亡率高[2]，對養(yǎng)禽業(yè)構成了極大威脅。目前，NDV疫苗的使用是預防該病的主要手段[3]。NDV F基因編碼的融合(F)蛋白是病毒感染細胞的重要成分，通過它完成病毒囊膜與細胞膜的融合，導致病毒穿過細胞膜進入細胞內復制[4]。

本實驗針對上海某珍禽場送檢的2只病死孔雀進行剖檢，結合其流行特點及發(fā)病情況疑以ND[5-7]。進行了NDV熒光RT-PCR檢測和F基因的序列分析，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 發(fā)病情況 該養(yǎng)殖場從2008年11月不斷出現(xiàn)發(fā)病孔雀，表現(xiàn)為精神沉郁，食欲減退，少數(shù)有神經(jīng)癥狀，發(fā)病5 d～6 d后，有2只死亡。

1.2 剖檢變化 送檢的2例孔雀，剖檢肝均有白色壞死灶或有萎縮，腸道萎縮、糜爛，其中一只胰腺和脾臟均有壞死灶。

1.3 細菌學診斷 分別無菌采集孔雀腦、心、肝、脾、腎、肺等組織樣品，接種于Glunbia羊血瓊脂上，置37℃培養(yǎng)24 h進行細菌分離檢測。

1.4 NDV熒光RT-PCR檢測 采集病鴿的腦、氣管、氣管粘液、肝臟、腎、肺等組織樣品，研磨，加入適量PBS制成懸液，7 500 r/min離心5 min，取上清，使用TaqMan探針NDV熒光RT-PCR檢測試劑盒(深圳匹基生物有限公司，批號：20081001)進行檢測。

1.5 F基因的克隆

1.5.1 引物的設計與合成 參考GenBank登錄的Guangxi10/2003株(DQ485261)F基因序列，設計了兩條特異性引物P1、P2，擴增長度為1 884 bp，引物由上海英駿生物技術有限公司合成，分別為：

P1：5'-TGATCCATCTCGACTGCTTAT-3'；

P2：5'-ACCCGTGTATTGCTCTTTG-3'。

1.5.2 病毒總RNA的提取 使用AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit提取病毒 RNA，具體操作按照說明書進行。

1.5.3 F基因的擴增 使用TaKaRa公司的一步法試劑盒對提取的病毒RNA進行RT-PCR擴增。反應體系為50 μL，擴增程序為：50℃反轉錄30 min，94℃2 min；再按以下條件進行30個循環(huán)：94℃30 s，45℃30 s，72℃2 min；最后72℃延伸10 min。結束后取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.5.4 F基因的克隆及序列分析 鑒定陽性的樣本PCR產物，由上海英駿生物技術有限公司測序。測序結果用DNAStar軟件分析，同時與GenBank登錄的其他NDV F基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進行同源性比較。

2 結果與討論

2.1 細菌學診斷 Glunbia羊血瓊脂培養(yǎng)皿中未見有細菌生長。

2.2 NDV熒光RT-PCR檢測 2只孔雀病毒核酸檢測結果均為NDV陽性(圖1)。

2.3 目的基因擴增 應用所設計的特異引物，2份樣品均擴增出預期的基因片段，大小為1884bp(圖2)。

2.4 F基因的同源性分析與遺傳進化樹構建 為了進一步了解該毒株在遺傳進化上的關系，應用DNAStar軟件對該毒株的F基因與GenBank登錄的10株國內外NDV F基因核苷酸進行比對，其同源性為81.1%～96.8%，推導的氨基酸序列同源性為78%～86.6%，其中與GenBank登錄號為EF592508的黑龍江株同源性高達96.8%，與弱毒疫苗Lasota株的同源性只有81.1%。F基因的遺傳進化樹分析顯示，該株與黑龍江毒株的遺傳距離最近(圖3)。但該株與Lasota株的同源性僅為81.1%，Lasota疫苗株免疫保護作用有待于進一步研究。

本研究中該毒株與黑龍江強毒株的核苷酸序列及其推導的氨基酸序列的同源性最高，遺傳進化系譜樹分析兩者的親緣關系最近，推測該毒株與黑龍江強毒株一樣同屬于強毒株，這為該毒株的毒力和致病性判斷提供了分子生物學依據(jù)，這個推測與之前對NDV的生物學、免疫學特性以及NDV行業(yè)檢測標準檢測結果相符[9]。推導的氨基酸序列比對中，在117位～142位氨基酸區(qū)間內即融合多肽，NDV強毒株的融合多肽起始于苯丙氨酸(F)，而NDV弱毒株融合多肽起始于亮氨酸(L)，這也為NDV強弱毒的區(qū)分，從分子生物學角度提供了新的途徑。然而Morrison等通過構建兩株NDV強毒株的突變體證實融合多肽的氨基端苯丙氨酸與融合作用無關，與F0的裂解有關[10]。

在序列比對中還發(fā)現(xiàn)，雖然所得到的NDV F基因的核苷酸序列的全長為1 662 bp，與所比對的序列大小一致，但在F基因的核苷酸668處有一個T插入，并在867處缺失了一個T(圖4)，該毒株和黑龍江參考毒株核苷酸同源性為96.8%，但推導的氨基酸序列的同源性卻為86.6%。雖然兩者的遺傳關系最近，對于是否由于T的插入和缺失增強了該病毒對孔雀的易感性，還有待深入研究。

隨著畜禽業(yè)的發(fā)展，特種養(yǎng)殖在養(yǎng)殖業(yè)中的比例也不斷增加，目前我國的免疫大都只局限于家禽，由于火雞和孔雀的易感性較低[1]，所以忽視了對孔雀等珍禽的免疫。本研究從孔雀內臟病料分離到NDV，通過病原學檢測及對SPF雞胚致病性指標的測定，確定感染的為強毒株。該毒株極易成為家禽和其它野生鳥類的傳染源，因此提示特種畜禽的免疫工作也不可忽視，相關的病原感染來源及對其它鳥類的致病性等還有待進一步研究。

[1]殷震，劉景華.動物病毒學[M].2版.北京：科學出版社，1997：743-748.

[2]Alerander D J.Newcastle disease and other abian paramyxoviruse.Review[J].Rev Sci Tech,2000.19(2):443-462.

[3]Letellier C,Burny A,Meulemans G.Contruction of a pigeonpox virus recombiant:espression of the Newcastle disease vrius(NDV)fusion glycoprotein and protection of chickens against NDV challenge[J].Arch Virol,1991.118(1-2):43-56.

[4]Doms R W,Lamb R A,Rose J K,et al.Folding and assembly of viral membrane proteins[J].Virology,1993.193(2):545-562.

[5]武志強，于文濤，馮衛(wèi)星，等.新城疫強毒(粵北株)的分離鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2006，42(11)：52-53.

[6]俞伏松，胡奇林，陳少鶯，等.1株雞新城疫強毒株的分離與鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2001，37(8)：24-25.

[7]王新衛(wèi)，王巖，張建武.新城疫野毒株的分離鑒定[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W校學報，2001，21(2)：81-83.

[8]Toyoda T,Sakaguchi T,Hirota H,et al.Newcastle disease virus evolution.Ⅱ.Lack of gene recombination in generating virulent and abirulent strans[J].Virology,1989.169(2):273-282.

[9]Li Z,Sergel T,Razvi E,et al.Effect of clervage mutants on syncytium formation directed by the wild-type fusion protein of Newcastle disease virus[J].J Virol,1998.72(5):3789-3795.

[10]Morrison T,McQuan C,sergel T,et al.The tole of the amino terminus of F1 of the Newcastle disease virus fusion protein in cleavage and fusion[J].Virology,1993.193(2):997-1000.