周作勇，聶奎，胡世君，羅洪林，湯明，胡友蘭，唐成，於劍，席進

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶402460；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶400715；3.重慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督總站，重慶401147；4.重慶市中藥研究院，重慶400065)

重慶地區(qū)山羊嗜血支原體(附紅細胞體)感染率調(diào)查及危險性因素評估

周作勇1，聶奎2*，胡世君1，羅洪林2，湯明3，胡友蘭3，唐成2，於劍4，席進1

(1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶402460；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶400715；3.重慶市動物衛(wèi)生監(jiān)督總站，重慶401147；4.重慶市中藥研究院，重慶400065)

為調(diào)查山羊嗜血支原體(附紅細胞體)在重慶地區(qū)的感染率并評估危害其感染的因素，本研究將采集于重慶14個區(qū)縣的共1 191份山羊血液樣本，分別采用染色鏡檢和PCR方法進行檢測，并對不同養(yǎng)殖方式和地理條件進行分析。結(jié)果顯示：山羊嗜血支原體感染率為16.1%，其中丘陵地區(qū)感染率(13.7%)低于山區(qū)(18.6%)，規(guī)?；B(yǎng)殖場感染率(14.3%)低于農(nóng)戶散養(yǎng)(17.1%)。危險性因素分析結(jié)果顯示：山區(qū)山羊嗜血支原體感染率是丘陵地區(qū)的1.43倍(OR 1.43，95%CI 1.05-1.95；χ2=5.13，d.f.=1，p=0.02)，并且差異顯著；農(nóng)戶散養(yǎng)山羊嗜血支原體感染率是規(guī)?；B(yǎng)殖的1.23倍(OR 1.23，95%CI 0.88-1.71；χ2=1.51，d.f.=1，p=0.22)，差異不顯著。表明不同的地理條件與山羊嗜血支原體感染率密切相關(guān)。

山羊嗜血支原體(附紅細胞體)；感染率；危險性因素

羊嗜血支原體(附紅細胞體)病是由羊嗜血支原體(Haemotrophic Mycoplasma)寄生于紅細胞表面或血漿，引起羊以溶血性貧血、黃疸、增重率低和精神沉郁為主要癥狀的一類疾病[1-2]。我國最早于1982年報道了羊嗜血支原體病。近年來，該病的發(fā)生和報道日漸增多，給養(yǎng)羊業(yè)造成一定的經(jīng)濟損失[3-9]。由于目前尚無系統(tǒng)的羊嗜血支原體感染流行病學(xué)調(diào)查資料，因此很難對該疾病所造成的危害進行評估。本研究采用PCR結(jié)合傳統(tǒng)檢測嗜血支原體的方法，對重慶地區(qū)山羊嗜血支原體進行感染率調(diào)查，并對不同地理條件和養(yǎng)殖方式進行分析，以此評估危害該病感染的因素。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本采集及主要試劑根據(jù)重慶市地理特點[10]，選擇榮昌、城口、石柱和秀山等14個區(qū)縣，對山羊頸靜脈采血。羊嗜血支原體陽性樣本由本實驗室保存；Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均購于TaKaRa公司；全血基因組DNA提取試劑盒購于Promega公司。

1.2 顯微鏡檢查血樣采用滅菌生理鹽水稀釋，壓片鏡檢。同時按照文獻[11]方法進行瑞氏染色和姬姆薩染色鏡檢。

1.3 PCR檢測

1.3.1 DNA模板的制備將抗凝血2 000 r/m in，離心2 min，按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA。以羊嗜血支原體陽性樣本做對照。

1.3.2 引物設(shè)計及合成參考GenBank登錄的羊嗜血支原體16S rRNA序列(AF338268)，利用Oligo6.1軟件設(shè)計特異性引物，5'-CGAACGAGTAGAACTTG TTCTGCT-3'和5'-TAGTACCATCAAGGCGCGCTCA T-3'，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，擴增片段長度為420 bp。

1.3.3 PCR檢測PCR反應(yīng)程序：94℃5m in；94℃30 s、58.5℃30 s、72℃30 s，30個循環(huán)；72℃7m in。產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 危險性因素分析根據(jù)PCR檢測結(jié)果，以養(yǎng)殖方式和地理條件作為評估該病的危險性因素，計算比數(shù)比(OR)和95%的置信度(95%CI)，以SPSS 11.5軟件進行卡方檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCR檢測與常規(guī)方法檢測結(jié)果比較采用不同方法對重慶市14個區(qū)縣1 191份山羊血液樣本進行檢測，結(jié)果如表1所示。其中PCR方法檢測感染率以石柱、忠縣、武隆最高，均在20%以上；城口、豐都、銅梁、秀山等次之，感染率在16%～20%之間；而榮昌、永川、大足和江津等區(qū)縣的感染率較低，表明重慶市渝東地區(qū)的羊嗜血支原體感染率高于渝西地區(qū)。4種檢測方法的結(jié)果顯示，鮮血壓片法、瑞氏染色法、姬姆薩染色法和PCR方法平均檢出率分別為61.0%、66.8%、70.4%和16.1%。傳統(tǒng)涂片染色鏡檢的檢測陽性率顯著高于PCR方法，主要原因可能有兩個方面，其一，由于紅細胞的變形、涂片染色時的染色顆粒沉積、顯微鏡質(zhì)量差異等原因可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性[5,11]；其二，山羊嗜血支原體病一般以隱性感染為主，如果山羊感染了其他血液寄生病原如無形體等，目前僅靠普通光學(xué)顯微鏡無法分辨出差異，從而造成假陽性[1,13-14]。因此，傳統(tǒng)鏡檢方法判斷羊嗜血支原體感染結(jié)果不準確，而本研究采用PCR方法的檢測結(jié)果進行羊嗜血支原體感染危險性的分析。

2.2 羊嗜血支原體感染的危險性因素根據(jù)PCR檢測結(jié)果進行感染危險性因素分析，結(jié)果如表2所示。由不同的地理條件，山區(qū)羊嗜血支原體感染率顯著高于丘陵地區(qū)，分別為18.6%和13.7%，山區(qū)的感染率是丘陵地區(qū)的1.43倍，并且差異顯著(OR=1.43，95%CI為1.05-1.95，χ2=5.13，d.f.=1，p=0.02)，表明山區(qū)和丘陵不同的地理條件是山羊感染嗜血支原體的危險性因素。由不同養(yǎng)殖方式分析，農(nóng)戶散養(yǎng)山羊嗜血支原體感染率是規(guī)?；B(yǎng)殖的1.23倍，分別為17.1%和14.3%，但差異不顯著(OR=1.23，95%CI為0.88-1.71，χ2=1.51，d.f. =1，p=0.22)。有研究表明羊嗜血支原體主要通過活的媒介物如蜱、螨等吸血節(jié)肢動物傳播[3,12]，在山區(qū)的地理條件下，山羊接觸蜱、螨等吸血昆蟲的機率遠高于丘陵地區(qū)，因而更容易傳播羊嗜血支原體，這也成為該病原感染的危險性因素。雖然農(nóng)戶散養(yǎng)山羊也容易接觸傳播媒介，本次調(diào)查的結(jié)果也顯示散養(yǎng)山羊嗜血支原體的感染率高于規(guī)模化養(yǎng)殖，但無顯著性差異，因此，養(yǎng)殖方式并非山羊感染嗜血支原體的直接危險性因素。究其原因可能是采集的血液樣本分別為山區(qū)地理條件下山羊規(guī)?；B(yǎng)殖以及丘陵地區(qū)農(nóng)戶散養(yǎng)模式下的血液樣本導(dǎo)致的。

表1 PCR方法與常規(guī)檢測方法對羊嗜血支原體感染檢測結(jié)果的比較Table 1 Comparison of Haemotrophic Mycoplasma infection rate detected w ith PCR and other routinemethods

表2 重慶地區(qū)山羊感染嗜血支原體危險性因素分析Table 2 Risk factors analysis for Haemotrophic Mycoplasma infection of goats in Chongqing

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(本文編輯：張朝霞)

Infection rate and risk factors analysis of Haemotrophic Mycoplasm a(form erly Eperythrozoon ovis)in Chongqing area

ZHOU Zuo-yong1,NIE Kui2*,HU Shi-jun1,LUO Hong-lin2,TANG M ing3,HU You-lan3, TANG Cheng2,YU Jian4,XIJin1
(1.Rongchang Campus,Southwest University,Chongqing 402460,China;2.College of Animal Science and Technology, Southwest University,Chongqing 400715,China;3.Chongqing Animal Health Supervision Station,Chongqing 401147,China; 4.Chongqing Academy of Chinese Materia Media,Chongqing 400065,China)

In this study,we collected 1 191 goat blood samples from 14 counties in Chongqing area,of which detected Haemotrophic Mycoplasma(formerly Eperythrozoon ovis)by staining m icroscopy and 16S rRNA-PCR,and the geographic condition and breed mode were evaluated as risk factors associated w ith the infection.The results showed that 16.1%of samples were detected Haemotrophic Mycoplasma positive infection,of which 13.7%were in hilly areas and 18.6%in mountain areas. The infection rate of Haemotrophic Mycoplasma in scale farm(14.3%)was lower than that of unscaled farm(17.1%).Infection rate of Haemotrophic Mycoplasma of goats breed inmountain areaswas 1.43 times higher than that in hilly areas(OR=1.43,95% CI=1.05-1.95;χ2=5.13,d.f.=1,p=0.02),Infection rate in goats w ith Scatter-Feed mode was 1.23 times higher than that of intensive culture(OR=1.23,95%CI=0.88-1.71;χ2=1.51,d.f.=1,p=0.22).The results demonstrated that different geographic condition was highly associated w ith Haemotrophic Mycoplasma infection of goats.

Haemotrophic Mycoplasma(formerly Eperythrozoon ovis);infection rate;risk factors

S852.64

A

1008-0589(2010)07-0563-04

*Corresponding author

2009-08-11

重慶市自然科學(xué)基金重點資助項目(2006BA1009)

周作勇(1979-)，男，四川冕寧人，博士研究生，講師，主要從事動物傳染病和寄生蟲病研究.

*通信作者：E-mail：niekui@126.com