石文達(dá)，劉永剛，王洪峰，王淑杰，馬 平，徐 敏，武佳斌，蔡雪輝

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室/豬傳染病研究室，黑龍江哈爾濱150001)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，表現(xiàn)為母豬繁殖障礙和仔豬及生長豬呼吸系統(tǒng)障礙[1]。1987年，美國首先報道了該病的發(fā)生。PRRS自20世紀(jì)90年代中期在我國發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已廣泛存在，并且疫情較為嚴(yán)重[2-3]。Meulenberg等1993年首先完成了第一個歐洲型PRRS病毒(PRRSV)分離株Lelystad的全基因組克隆和測序，隨后，美洲型分離株的全基因組測序相繼被完成。Faaberg等2001年對商品化疫苗株RespPRRS MLV進(jìn)行了全基因組測序，并與親本株ATCC VR-2332的全序列進(jìn)行了比較分析，數(shù)據(jù)顯示只有ORF7基因和3'UTR區(qū)域未發(fā)生變異。而國內(nèi)對致弱毒株的全基因組測序報道較少。

本研究通過對國內(nèi)的PRRSV致弱疫苗株CH-1R株進(jìn)行全基因組的克隆和測序，填補了我國PRRSV致弱毒株基因組信息數(shù)據(jù)的空白，同時對了解PRRSV致弱毒株的基因型及防制具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 病毒株 PRRSV為CH-1R株[4]，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所保存[5]。本研究采用CH-1a致弱毒株的第171代，即CH-1R株。

1.2 菌種、質(zhì)粒和試劑E.coliJMl09菌種由本室保存；克隆載體pMD18-T載體和常用工具酶及試劑盒購自寶生物技術(shù)工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中登錄的16株P(guān)RRSV全基因組序列，用Oligo 6.0軟件經(jīng)多重比較后，設(shè)計8對順序重疊的特異性引物(如有需要，作者可以提供)。

1.4 病毒的增殖與RNA的提取 將病毒在Marc-145細(xì)胞中培養(yǎng)，收獲病毒。按TRIzol LS試劑說明書操作方法，提取病毒總RNA。

1.5 CH-1R株基因片段的RT-PCR

1.5.1 基因編碼序列的RT-PCR擴(kuò)增 PRRSV CH-1R株的RT-PCR擴(kuò)增按文獻(xiàn)[6]進(jìn)行。

PCR循環(huán)參數(shù)為：95℃5min；94℃1min、55℃1 min、72℃3 min，共30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5.2 基因組5'末端和3'末端的RT-PCR擴(kuò)增 采用TaKaRa RNA PCR Kit擴(kuò)增病毒的3'末端； 以5'Full RACE Core Set試劑盒擴(kuò)增病毒的5'末端。

1.6 RT-PCR產(chǎn)物的克隆和重組質(zhì)粒的序列測定產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行純化，具體方法參見TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0。將經(jīng)過回收的PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化，篩選陽性重組質(zhì)粒，對其進(jìn)行序列的測定。

1.7 序列測定與全基因組序列的拼接及分析為保證序列的準(zhǔn)確性，每一個片段分別進(jìn)行3次獨立的克隆，由上海生物工程有限公司測序。根據(jù)SeqmanⅡ軟件拼接PRRSV CH-1R株全基因組序列，同時應(yīng)用DNAStar軟件對CH-1R株與CH-1a株序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 PRRSV CH-1R株的全基因組各片段的克隆和鑒定 應(yīng)用所設(shè)計的引物，對CH-1R株分為8個片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。

2.2 全基因組序列測定及分析 經(jīng)測序和拼接表明：PRRSV CH-1R株基因組全長15 424 nt；其中，含有9個開放閱讀框架(ORF)，5'端UTR之后是兩個重疊的大 ORF，即 ORF1a和 ORFlb(約 11.9 kb)，隨后是 6個小的 ORF及 3'端 UTR和 poly(A)尾。全基因組組成及推導(dǎo)的氨基酸位置見表1。其基因組全序列已錄入GenBank，登錄號為EU807840。

2.3 5'端UTR和3'端UTR的序列分析 測序結(jié)果顯示PRRSV CH-1R株與親本株CH-1a株的5'UTR和3'UTR相對保守。其5'UTR僅存在1處(36位)核苷酸變異。3'UTR高度保守的8核苷酸序列中的僅第4位核苷酸由A突變?yōu)镃。

2.4 病毒非結(jié)構(gòu)蛋白序列分析 PRRSV的13個非結(jié)構(gòu)蛋白基因由ORF1a與ORFlb編碼的兩個多聚蛋白裂解形成，即 Nsp1(包括 Nsp1α，Nsplβ)～Nsp12。CH-1R株 ORF1a長7 509 nt，共編碼 2 501個氨基酸，CH-1R株與CH-1a株的ORF1a推導(dǎo)的氨基酸序列比較，共有18處變異；其中11處變異位于Nsp2蛋白、3處變異位于Nsp3蛋白、1處變異位于Nsp4、2處變異位于Nsp5蛋白及1處變異位于 Nsp7蛋白(圖2)。

表1 PRRSV CH-1R株和CH-1a株病毒RNA的全基因組組成及編碼蛋白Table 1 The comparison of genome organization and the encoded proteins by the CH-1R and CH-1a viral RNA

在動脈炎病毒屬中，Nsp2為高度變異蛋白，通過CH-1R株與CH-1a序列比較顯示，Nsp2存在多處核苷酸的改變；而且在2 191 bp～2 193 bp處發(fā)生了連續(xù)3個核苷酸的缺失，導(dǎo)致相應(yīng)位置推導(dǎo)出的2個連續(xù)的氨基酸發(fā)生改變；其中位于第630位的氨基酸發(fā)生缺失以及R631E連續(xù)突變，另外還有9個其他位點的氨基酸序列均發(fā)生了變異。

ORF1b編碼的聚合蛋白，其中有3個推測的3C-like蛋白酶裂解位點，結(jié)果裂解產(chǎn)生4個小蛋白，即 NSP9和推定的裂解產(chǎn)物 NSP10，NSP11，NSP12。但在ORF1b中并沒有推定的蛋白酶區(qū)域，同其它動脈炎病毒一樣，其聚合蛋白可能是由ORFla所編碼的蛋白酶來執(zhí)行切割功能[7]。

CH-1R株與CH-1a株的ORF1b推導(dǎo)的氨基酸序列比較，共有15處發(fā)生了變異，其中有6處變異位于Nsp9蛋白、5處變異位于Nsp10蛋白、2處變異位于Nsp11、2處變異位于Nsp12蛋白。特別是在NSP9(456位)和NSP11(1 272位)蛋白的高度保守的區(qū)域氨基酸發(fā)生了改變(圖3)。

2.5 病毒結(jié)構(gòu)蛋白序列分析 比較CH-1R株與CH-1a株的各結(jié)構(gòu)蛋白的推導(dǎo)氨基酸序列，共有17處變異，突變氨基酸及其位置詳見表2。表中數(shù)據(jù)顯示，在各結(jié)構(gòu)蛋白序列中GP5和GP3變異較大，而相對保守M蛋白和N蛋白同樣也發(fā)生了變異。通過對變異較大的GP5蛋白的序列比較顯示，在5位、38位、146位氨基酸發(fā)生了變異。這3處氨基酸是否是毒力的決定位點，還有待進(jìn)一步證實。

表2 結(jié)構(gòu)蛋白毒力相關(guān)氨基酸的推測及變異分析Table 2 Comparison of predicted amino acids mutations of structural protein involved in pathogenisis

3 討 論

RNA病毒的5'UTR區(qū)和3'UTR區(qū)與病毒基因組的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及mRNA的翻譯密切相關(guān)[8]。通過序列比較，CH-1R株5'UTR區(qū)和3'UTR區(qū)各存在一處核苷酸變異，是否與病毒的細(xì)胞中的生長特性有關(guān)，有待進(jìn)一步驗證。非結(jié)構(gòu)蛋白編碼區(qū)的序列比較顯示，ORF1b的序列變異不大，但ORF1a的變異相對較大，尤其是Nsp2的變異，同CH-la株相比，CH-1R株存在11處核苷酸的點突變，包括3個連續(xù)核苷酸發(fā)生缺失，導(dǎo)致推導(dǎo)出的2個連續(xù)氨基酸突變，即其中位于630位的氨基酸發(fā)生缺失以及R631E連續(xù)突變，因此我們推測R631可能是一個重要的毒力決定位點。

PRRSV編碼的6種結(jié)構(gòu)蛋白與親本株序列比較共有11處氨基酸發(fā)生了變異。GP5、M和N是PRRSV的3種主要結(jié)構(gòu)蛋白，美洲型毒株間GP5蛋白氨基酸的置換主要發(fā)生在鄰近信號肽序列外區(qū)近端的高變區(qū)內(nèi)(26 aa～39 aa)[9]，將CH-1R株的高變區(qū)序列與CH-1a株序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)C5Y和L146Q位發(fā)生了變異。其中L146Q位于糖蛋白的疏水區(qū)，該氨基酸的變異有可能與病毒毒力的降低有關(guān)。

M蛋白在所有PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中具有高度保守性，通過序列比較顯示，CH-1R株只有Q16L發(fā)生了點突變。M蛋白與受體介導(dǎo)的病毒感染密切相關(guān)，可能在病毒裝配和出芽中起重要作用，因此推測Q16L可能是毒力致弱的一個決定位點。

一般認(rèn)為PRRSV和其它動脈炎病毒一樣，整個復(fù)制過程只在胞漿中進(jìn)行，而最新的研究表明N蛋白主要集中在細(xì)胞核和核仁中[10]。N蛋白有兩個保守區(qū)分別位于10 aa～13 aa和41 aa～47 aa處，這2處氨基酸分別組成2個不同類型的核定位信號區(qū)(NLS：pat4和pat7)。CH-1R株與親本株CH-1a的序列比較顯示有兩處發(fā)生變異(R9Q和K46N)，K46N位于核定位信號區(qū)(pat7 NLS，41 aa～47 aa)，該區(qū)的功能是引導(dǎo)N蛋白進(jìn)入到細(xì)胞核中與宿主細(xì)胞纖維蛋白結(jié)合，同時具有與18S和28S的核糖體核糖核酸結(jié)合功能。而CH-1R株是在體外傳代致弱獲得的，是否由于宿主細(xì)胞的改變導(dǎo)致pat7 NLS區(qū)域的變異，進(jìn)而改變了病毒的嗜性，還有待深入的研究。

綜上所述，CH-1R株的變異具有規(guī)律性，ORF1a基因的R631E、ORF5基因的 L146Q、ORF6基因的Q16L和ORF7基因的K46N這4處氨基酸在CH-1R株的致弱過程中發(fā)生的變異是否與毒力的減弱有關(guān)，還有待于進(jìn)一步的研究。

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