鄭崛村，沈富兵，鄧念華，孟延發(fā)（.成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，四川 成都 60083； .四川大學(xué)生命科學(xué)院，四川 成都 60064）

重組人紅細(xì)胞生成素（recombinant human erythropoietin, rhEPO）常用于治療慢性腎功能不全性貧血以及腫瘤化療、艾滋病毒感染、骨髓異常增生綜合征等引起的貧血。由于其體內(nèi)半衰期只有6～9 h，臨床病人需每周注射3次才能達(dá)到治療效果，并且需要長(zhǎng)期使用。為了減少病人的痛苦和治療費(fèi)用，我們研制了聚乙二醇化重組人紅細(xì)胞生成素（PEG-rhEPO），即用聚乙二醇活性酯對(duì)rhEPO進(jìn)行化學(xué)修飾，使PEG與rhEPO通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合而形成PEG-EPO，增加相對(duì)分子質(zhì)量，并封閉部分蛋白酶作用位點(diǎn)，以便延長(zhǎng)體內(nèi)循環(huán)半衰期。同時(shí)，PEG在蛋白質(zhì)表面具有遮蔽分子表面抗原決定簇的作用[1]，降低免疫原性,減少特異性抗體的產(chǎn)生，可提高藥物的穩(wěn)定性[2-3]。迄今已有尿激酶、水蛭素、血紅蛋白、干擾素、白介素-2、粒細(xì)胞集落刺激因子等PEG化學(xué)修飾的蛋白藥物面世[4]。本文擬采用放射性標(biāo)記法（125I標(biāo)記PEG-EPO），研究PEG修飾的EPO在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)，并獲取體內(nèi)半衰期等主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，觀察PEG修飾后的長(zhǎng)效效果及相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征。

1 材料

1.1 藥品與試劑

基因重組CHO-EPO工程細(xì)胞株經(jīng)大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)和純化，獲得EPO，以分子量為20 KD的PEG對(duì)EPO進(jìn)行修飾，并經(jīng)分離獲得PEG-EPO，純度 ＞98%，11.5 mg·mL-1。臨用時(shí)，以0.9%氯化鈉注射液將原液稀釋至低、中、高劑量所需濃度。Iodogen（Sigma公司），Na125I（無(wú)還原劑，英國(guó)Amersham公司），三氯醋酸（江蘇如皋市化學(xué)試劑廠）。3 mm CHR層析紙（英國(guó)Whatman公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠18只，雌雄各半，體重225～372 g，由上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）-2003-0002。

1.3 儀器

FH463-A型自動(dòng)定標(biāo)器（北京核儀器廠）；BSZ-160型自動(dòng)部份收集器（上海滬西儀器廠）；XH-6010A型全自動(dòng)γ閃爍計(jì)數(shù)儀（西安262廠）；XHF-1內(nèi)切式勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LDR4-8.4C低溫離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；Sephadex（G-50，Pharmacia公司）。

2 測(cè)定方法的建立和驗(yàn)證

2.1 125I-PEG-EPO的制備、純化、鑒定

2.1.1125I-PEG-EPO的制備 采用Iodogen法碘化標(biāo)記PEG-EPO。125I-PEG-EPO的標(biāo)記率在35%～38%之間，125I-PEG-EPO放射性比活度：176～192 Bq·ng-1。

2.1.2125I-PEG-EPO標(biāo)記物的純化 采用Sephadex G-50凝膠柱層析過(guò)濾法。層析柱：10.0 mm×300 mm；淋洗液：0.05 mol·L-1PBS ( pH 7.4)。方法：將標(biāo)記混合液上柱后，用淋洗液洗脫并分管收集洗脫液。分管測(cè)量洗脫液的放射性強(qiáng)度。收集125I-PEG-EPO峰（蛋白峰）的各管洗脫液混合即為本標(biāo)記所得到的目標(biāo)化合物125I-PEG-EPO。

2.1.3125I-PEG-EPO的質(zhì)量鑒定 （1）放射化學(xué)純度測(cè)定：采用三氯醋酸沉淀法（TCA法）對(duì)標(biāo)記物125I-PEG-EPO進(jìn)行測(cè)定，平均放射化學(xué)純度為（97.08±1.44）% （n= 5），略高于紙層析法；放射性紙層析方法（PLC）用0.9%氯化鈉注射液作為展開(kāi)劑，經(jīng)紙層析分段測(cè)定得到放化純度，平均放化純度為（95.93±2.81）% （n= 5）。（2）125I-PEG-EPO貯存穩(wěn)定性測(cè)試：分別在4 ℃和室溫（10～12 ℃）條件下，用TCA法測(cè)定在貯存不同時(shí)間后放射性標(biāo)記物125I-PEG-EPO的放射化學(xué)純度；測(cè)量數(shù)據(jù)表明，125IPEG-EPO在4 ℃下保存5 d基本保持穩(wěn)定，放化純度＞ 95%，在室溫下能存放24 h。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 125I-PEG-EPO放射化學(xué)純度的穩(wěn)定性測(cè)試(TCA法)Tab 1 Stability measurement of radiochemical purity of 125IPEG-EPO (TCA)

2.2 大鼠全血PEG-EPO原型藥的分離

樣品加入2倍體積20%三氯醋酸，混勻，3000 r·min-1離心10 min，棄上清，沉淀即為原型藥，測(cè)定沉淀的放射計(jì)數(shù)，根據(jù)校正曲線即可得到藥物濃度。

2.3 大鼠全血PEG-EPO測(cè)定的校正曲線

在方法驗(yàn)證和藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)中均將PEGEPO設(shè)置為低、中、高3個(gè)劑量組，分別為3，9，27 μg·kg-1的靜脈注射劑量。PEG-EPO工作液（2.65×104cpm·μL-1）用大鼠空白全血制備放射性濃度為150，500，1000，5000，10 000，50 000，100 000，150 000 cpm/200 μL；其與低、中、高劑量組對(duì)應(yīng)PEG-EPO濃度分別為39.075，26.050，13.025，2.605，1.302，0.260，0.130，0.039 ng·mL-1；127.505，85.004，42.502，8.500，4.250，0.850，0.425，0.128 ng·mL-1；427.527，285.018，142.509，28.502，14.251，2.850，1.425，0.428 ng·mL-1。各劑量組各濃度校正品取200 μL，用TCA法分離原型藥與代謝物，在γ計(jì)數(shù)儀上測(cè)定放射性cpm，以PEG-EPO濃度對(duì)其所對(duì)應(yīng)的TCA沉淀物放射性計(jì)數(shù)cpm回歸，即可得到各組的校正曲線。結(jié)果顯示：PEG-EPO濃度與cpm呈直線相關(guān)，低、中、高各劑量組線性方程分別為y= 0.000 26x+ 0.001（r2= 0.999 9）、y= 0.000 9x-0.007（r2= 0.997 3）、y= 0.002 8x+ 0.008（r2= 0.999 9），定量下限（LLOQ）和定量上限（ULOQ）分別是0.039，39.075；0.128，127.505；0.428，427.527 ng·mL-1，各自覆蓋了該劑量組全部待測(cè)全血樣品的濃度范圍。

2.4 精密度測(cè)定

PEG-EPO工作液用大鼠空白全血配制理論放射性濃度為400，20 000，110 000 cpm/200 μL；400，20 000，95 000 cpm/200 μL；400，20 000，110 000 cpm/200 μL；在低、中、高劑量組中PEG-EPO濃度分別為0.104，5.210，28.655 ng·mL-1；0.340，17.001，80.754 ng·mL-1；1.140，57.004，313.520 ng·mL-1的質(zhì)控樣品。用TCA法測(cè)定各劑量組質(zhì)控樣品125I-PEGEPO的實(shí)際放射性計(jì)數(shù)值。日內(nèi)每個(gè)質(zhì)控樣品測(cè)定5次，連續(xù)測(cè)定5 d。低、中、高劑量組的日內(nèi)和日間精密度RSD分別為1.78%～5.19%，5.73%～8.48%；1.53%～4.34%，4.32%～6.62%；3.72%～5.99%，5.45%～6.69%。

2.5 回收率測(cè)定

將PEG-EPO工作液用大鼠空白全血配制成低、中、高濃度梯度的質(zhì)控樣品，各組濃度梯度分別為400，20 000，110 000 cpm/200 μL；400，20 000，95 000 cpm/200 μL；400，20 000，110 000 cpm/200 μL。PEGEPO濃度分別相當(dāng)于0.104，5.210，28.655 ng·mL-1；0.340，17.001，80.754 ng·mL-1；1.140，57.004，313.520 ng·mL-1，用TCA法測(cè)定其125I-PEG-EPO的實(shí)際放射計(jì)數(shù)值。結(jié)果顯示：在各劑量組各自定量限范圍內(nèi)，低、中、高劑量組的全血PEG-EPO測(cè)定平均回收率分別為95.75%～103.38%，97.88%～104.89%，99.30%～ 115.68%。

3 TCA法測(cè)定大鼠全血125I-PEG-EPO濃度

3.1 動(dòng)物分組和給藥

18只大鼠分為3組，每組6只，雌雄各半。包括本次及其以下的所有試驗(yàn)都要在給藥前12 h行大鼠腹腔注射1%KI溶液1 mL，用以封閉甲狀腺。設(shè)高、中、低（27，9，3 μg·kg-1）3個(gè)劑量組，給藥的放射強(qiáng)度分別為1.214，1.357，1.476 MBq·kg-1。給藥體積均為2 mL·kg-1。頸靜脈推注給藥，10 s內(nèi)完成。分別于靜脈給藥后0，0.017（1 min），0.083（5 min），0.5，2，4，10，24，48，72，96，120 h 取全血約0.5 mL，抗凝，4 ℃貯存。

3.2 樣品血藥濃度測(cè)定

采用TCA法分離原型藥，并測(cè)定其放射性，分別用各劑量組的TCA法全血PEG-EPO校正曲線求得樣品的PEG-EPO濃度。放射強(qiáng)度衰變校正方法同“2.3”。

3.3 統(tǒng)計(jì)分析與結(jié)果判定

根據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度，繪出經(jīng)時(shí)血藥濃度曲線圖。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件DASver1.0計(jì)算主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行組間方差分析，以判斷受試物體內(nèi)過(guò)程是否呈現(xiàn)劑量依賴性。

4 結(jié)果

4.1 大鼠單次靜脈注射3種劑量PEG-EPO的藥代動(dòng)力學(xué)研究

3個(gè)劑量組大鼠全血中血藥濃度-時(shí)間曲線比較見(jiàn)圖1。

圖1 不同劑量組（3，9，27 μg·kg-1）血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 1 Plasma concentration-time curves of three dose groups (3, 9,27 μg·kg-1)

4.2 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DASver1.0軟件進(jìn)行處理。遵循AIC最小原則，AUC、AUMC、MRT采用統(tǒng)計(jì)矩參數(shù)。低、中、高3個(gè)劑量組給藥后0.017 h（1 min）血藥濃度分別為（24.800±3.535），（80.971±16.368），（269.620±26.360） ng·mL-1，與劑量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 8；動(dòng)物血中藥物消除半衰期T1/2β分別為（27.22±3.67），（28.40±1.61），（33.12±1.83） h，隨劑量的增加無(wú)顯著變化；AUC0-120h分別為（69.22±7.13），（218.77±34.57），（470.42±65.88） ng·h·mL-1，與劑量呈正相關(guān)，r= 0.990 9，表明藥物在大鼠的體內(nèi)過(guò)程呈線性動(dòng)力學(xué)特征。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

5 討論

目前已有多家機(jī)構(gòu)開(kāi)發(fā)出了多種方法延長(zhǎng)EPO體內(nèi)半衰期的方法，一種是增加rhEPO 分子量如EPO分子與人白蛋白連接或與人IgG1 Fc融合[5]，或通過(guò)多肽（3～17個(gè)氨基酸）連接成為同源二聚體；另一種方法是采用基因工程技術(shù)提高EPO分子糖基化程度，如Amgen公司生產(chǎn)的第二代重組人EPO（AranespTM），在EPO分子原有基礎(chǔ)上另外增加2條N-連接糖鏈，增加含糖量[6]。我們用聚乙二醇修飾rhEPO，增加分子量并降低蛋白酶的降解，可有效延長(zhǎng)其體內(nèi)代謝，屬于第一種方法。

表2 大鼠單次靜脈注射PEG-EPO藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù).±sTab 2 Pharmacokinetic parameters of PEG-EPO after single intravenous injection in rats.±s

表2 大鼠單次靜脈注射PEG-EPO藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù).±sTab 2 Pharmacokinetic parameters of PEG-EPO after single intravenous injection in rats.±s

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) 低劑量組 中劑量組 高劑量組A 8.134 2±1.170 6 32.723 8±6.479 6 59.442 9±8.210 4 α 0.372 8±0.110 4 0.414 3±0.115 4 0.314 4±0.062 2 B 1.079 4±0.400 2 2.871 0±0.755 0 5.299 1±1.043 6 β 0.025 9±0.003 6 0.024 5±0.001 4 0.021 0±0.001 1 T1/2α/h 2.00±0.56 1.80±0.57 2.28±0.44 T1/2β/h 27.22±3.67 28.40±1.61 33.12±1.83 Vd/L·kg-1 4.103 6±0.484 1 1.650 8±0.693 9 0.640 3±0.065 1 V1/L·kg-1 0.329 8±0.041 3 0.120 3±0.090 5 0.047 0±0.006 0 Cl/L·h-1·kg-1 0.047 1±0.005 8 0.020 2±0.011 1 0.006 9±0.001 0 K10/h-1 0.328 4±0.083 1 0.383 5±0.111 8 0.290 5±0.056 6 K12/h-1 0.041 0±0.029 7 0.028 8±0.008 5 0.022 2±0.005 7 K21/h-1 0.029 3±0.005 4 0.026 6±0.001 7 0.022 7±0.001 3 AUC0-120/ng·h·mL-1 69.22±7.13 218.77±34.57 470.42±65.88 AUC0-∞/ng·h·mL-1 71.72±7.65 226.35±34.52 496.57±68.51 AUMC0-1201 389.53±280.87 4 072.41±899.18 9 489.43±2 060.54 MRT0-120/h 19.93±2.06 18.54±2.06 20.01±1.56

rhEPO被PEG修飾后，rhEPO分子被PEG糖鏈包裹，一些分子表面的抗原表位被糖鏈遮蓋，將不利于用常規(guī)免疫分析法作為藥代動(dòng)力學(xué)檢測(cè)方法，如使用rhEPO單克隆抗體的夾心ELISA檢測(cè)分析法；而色譜分析法對(duì)于大分子量的蛋白類藥物顯然也不太適合。因此，本文選擇經(jīng)典的放射性標(biāo)記分析方法，開(kāi)展PEG-EPO的藥代動(dòng)力學(xué)研究，了解PEG修飾達(dá)到的長(zhǎng)效效果及動(dòng)力學(xué)特征。

本文采用三氯醋酸沉淀法（TCA）和直接測(cè)定樣品放射性計(jì)數(shù)法（RA）進(jìn)行示蹤研究。TCA能相對(duì)準(zhǔn)確的分離原型藥物，基本反映原型藥的放射性，而RA可以反映原型藥、代謝物以及游離125I（125I－）放射性總量。本試驗(yàn)所制備的放射性同位素示蹤劑125IPEG-EPO，其放射化學(xué)純度、比活度及其貯存穩(wěn)定性均符合示蹤實(shí)驗(yàn)的要求。EPO為含唾液酸的糖蛋白激素，分子中約40%為糖類，包括一個(gè)O-聯(lián)結(jié)和三個(gè)N-聯(lián)結(jié)的寡糖。EPO與PEG耦聯(lián)后進(jìn)入機(jī)體也會(huì)發(fā)生降解，僅測(cè)定總放射性強(qiáng)度不能真實(shí)反映原型藥的情況。因此，需要在全血等樣品中分離原型藥。本試驗(yàn)所用的三氯醋酸沉淀法對(duì)原型藥PEG-EPO與部分降解物和游離的125I－分離相對(duì)可靠。提高放射性比活度可以提高方法的靈敏度，但過(guò)高的放射性比活度會(huì)帶來(lái)不利影響，如標(biāo)記物的生物活性受損等，在滿足靈敏度的前提條件下，選用較低的放射性比活度，以保證標(biāo)記物的生物活性。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)在測(cè)試特異性、精確度、準(zhǔn)確度、靈敏度、標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定范圍以及線性關(guān)系等均符合藥代動(dòng)力學(xué)研究的技術(shù)要求。

本實(shí)驗(yàn)分別設(shè)高、中、低（27，9，3 μg·kg-1）3個(gè)劑量組，分別相當(dāng)于臨床擬用劑量的9，3，1倍，且3倍的劑量關(guān)系能較好顯示各劑量之間的差異。試驗(yàn)所制備的放射性同位素示蹤劑125I-PEG-EPO，其放射化學(xué)純度、比活度及其貯存穩(wěn)定性均符合示蹤實(shí)驗(yàn)的要求。由于EPO為大分子蛋白類藥物，如- 20℃儲(chǔ)存引起的反復(fù)凍融可損壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，故穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)只選用了室溫和4 ℃進(jìn)行考察。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PEG-EPO在大鼠體內(nèi)的消除半衰期是普通rhEPO的3～4倍，由此推測(cè)，PEG-EPO一次注射可以達(dá)到普通rhEPO三次或四次給藥的效果，這將明顯改善臨床上由于頻繁給藥給病人帶來(lái)的痛苦。我們還將開(kāi)展大動(dòng)物如獼猴等體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證PEG-EPO的長(zhǎng)效效果。

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