梁宇光，蘇 佳，董瑞華，劉澤源（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100071）

近年來，多項研究成果表明，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是萜類成分介導(dǎo)抗腫瘤作用的主要途徑[1-5]。本研究室在對香茶菜屬植物中提取分離的20余種新化合物做抗腫瘤活性初步評價時發(fā)現(xiàn)，其中一種名為苞葉香茶菜庚素（melissoidesin G, MOG）的二萜化合物對多種腫瘤細(xì)胞均顯示較強的體外抗腫瘤活性；且此化合物在植物中含量較高，遂對其抗腫瘤作用的相關(guān)分子機制進(jìn)行了研究。本研究擬通過探討MOG誘導(dǎo)白血病細(xì)胞系HL-60的凋亡效應(yīng)，闡明該化合物可能的抗腫瘤分子作用機制，也為進(jìn)一步研究和開發(fā)能應(yīng)用于臨床的天然植物類抗腫瘤新藥提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑、儀器

MOG由中國科學(xué)院昆明植物所分離純化。Caspase-3/7 試劑盒和caspase抑制劑Z-VAD-FMK（Promega公司）。JC-1（Molecular Probes公司）。抗cleaved-caspase-3， cleaved-caspase-7，cleavedcaspase-8，cleaved-caspase-9和anti-β-actin antibodies，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，辣根過氧化物酶顯色底物L(fēng)umiGLO?substrate（Cell Signaling公司）。BCATMProtein Assay Kit（Pierce公司）；其余試劑均購自Sigma公司。酶標(biāo)檢測儀（Clinic Bio生物技術(shù)公司）。流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人早幼粒白血病細(xì)胞系HL-60，人T細(xì)胞白血病細(xì)胞系Jurkat-T，人幼單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系U937，人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562，人B細(xì)胞急性淋巴性白血病細(xì)胞系Daudi，人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549，人宮頸癌細(xì)胞系Hela，人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，人前列腺癌細(xì)胞系PC-3為本室凍存；小鼠纖維瘤細(xì)胞系L929購自ATCC。上述細(xì)胞用含10%胎牛血清之RPMI1640或DMEM培養(yǎng)液在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 生長抑制試驗

選用MTT法測定。通過細(xì)胞計數(shù)將細(xì)胞濃度調(diào)整至105·mL-1，先加細(xì)胞懸液至96孔板中，再將不同濃度MOG分別加入96孔板的細(xì)胞懸液中，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，隨后加入MTT再培養(yǎng)4～5 h，用10% SDS終止反應(yīng)，約12 h溶解后于酶標(biāo)分析儀570 nm波長處測各孔OD值并計算IC50（半數(shù)有效抑制濃度）。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測

用PI單染法分析周期變化。收集不同時間、不同劑量MOG處理的細(xì)胞，PBS洗3次，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，70%乙醇4 ℃條件下固定過夜。檢測前用PBS洗2遍，然后加入RNase （1 mg·mL-1） 100 μL于37 ℃孵育30 min，加300 μL PI （50 μg·mL-1），避光孵育20 min后，用流式細(xì)胞檢測儀檢測。

用Annexin V/PI雙染法分析細(xì)胞凋亡，收集不同時間、不同劑量MOG處理后的細(xì)胞，用PBS洗3次，1000 r·min-1離心5 min，棄上清液，將細(xì)胞重懸于50 μL結(jié)合緩沖液，室溫孵育30 min后加入2.5 μL Annexin V-FITC和0.5 μL PI（10 mg·mL-1）繼續(xù)避光孵育5 min。加入400 μL PBS，1 h內(nèi)流式細(xì)胞檢測儀檢測。

1.5 線粒體膜電位(△Ψm)檢測

應(yīng)用膜電位依賴性結(jié)合的熒光探針JC-1標(biāo)記△Ψm的變化，1×106個HL-60細(xì)胞在室溫下與JC-1（5 μg·mL-1）反應(yīng)15 min，用PBS洗2遍后重懸，流式細(xì)胞儀檢測，JC-1單體（綠色熒光）和JC-1聚集體（紅色熒光）分別通過FL-1和FL-2通道收集，激發(fā)光波長527 nm，發(fā)射光波長590 nm。

1.6 Caspase活性檢測

依據(jù)Promega公司提供的Apo-ONE Homogeneous Caspase Assay試劑盒說明書進(jìn)行操作（熒光檢測激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為535 nm）。

1.7 免疫印跡(Western blotting)檢測

MOG處理后既定時間內(nèi)收集細(xì)胞，用冰冷的PBS洗細(xì)胞1次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液。細(xì)胞裂解處理后，將裂解液在4 oC條件下12 000 r·min-1離心10 min。等量蛋白(20 μg)進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳并電轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜后用特異性一抗孵育，洗膜，二抗孵育。結(jié)合的抗體用ECL顯色系統(tǒng)檢測。

2 結(jié)果

2.1 MOG與DDP對多種腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制活性

選擇10種人常見腫瘤細(xì)胞系用MTT法對MOG的細(xì)胞增殖抑制活性進(jìn)行評估，并與陽性對照藥順鉑（DDP）比較。結(jié)果表明，MOG對不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制程度不同。其中，血液系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞系普遍對MOG較敏感，如Jurkat-T，U937，K562及Daudi，其IC50均較低且?guī)缀踉谕凰健OG對腫瘤細(xì)胞系的增殖抑制強度與DDP相近。同批比較MOG與DDP對多種腫瘤細(xì)胞系的IC50見圖1。因HL-60相對其他細(xì)胞株對MOG最敏感，以下實驗均以HL-60為細(xì)胞模型研究。

2.2 MOG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步驗證MOG誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的具體形式，我們通過流式細(xì)胞術(shù)分析不同濃度的MOG與HL-60細(xì)胞共孵育24 h后細(xì)胞DNA含量的變化。結(jié)果表明：HL-60細(xì)胞在10 μmol·L-1MOG作用24 h后出現(xiàn)明顯的sub-G1峰，不同濃度MOG作用后sub-G1期細(xì)胞比例呈劑量依賴性升高，說明HL-60細(xì)胞正在經(jīng)歷凋亡（圖2）。通過Annexin V-FITC結(jié)合實驗可以分析細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度，如圖3所示，不同濃度MOG作用HL-60細(xì)胞9 h后，Annexin V陽性細(xì)胞的比例呈現(xiàn)很明顯的劑量依賴性升高，10，20 μmol·L-1MOG作用9 h后HL-60細(xì)胞幾乎全部凋亡。

圖3 MOG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的劑量效應(yīng)Fig 3 Dose course of the apoptotic effect induced by MOG in HL-60

2.3 MOG誘導(dǎo)△Ψm降低

線粒體在細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中起著不可替代的作用，△Ψm的變化可以直接反映線粒體功能狀態(tài)的改變。用JC-1作為熒光探針測定線粒體跨膜電位時，發(fā)現(xiàn)MOG作用HL-60細(xì)胞一定時間后，細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位會降低且呈時間依賴性（圖4）。紅綠熒光比值FL-2/FL-1反映線粒體膜電位水平變化，與對照組（FL-2/FL-1 = 5.55）比較，10 μmol·L-1的MOG作用細(xì)胞1.5 h后，膜電位水平有明顯降低（FL-2/FL-1= 1.93），9 h達(dá)最低值（FL-2/FL-1 = 0.02）。

圖4 MOG引起△Ψm改變的時間效應(yīng)Fig 4 Time course of change of △Ψm induced by MOG

2.4 Caspase激活在MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用

Caspase家族在細(xì)胞凋亡發(fā)生的過程中起著非常重要的作用，大多數(shù)凋亡過程均可檢測到caspase通路的激活，不同的細(xì)胞類型或不同的凋亡誘導(dǎo)劑可能激活不同的caspase家族成員。Western blotting實驗結(jié)果顯示，HL-60細(xì)胞在MOG（10 μmol·L-1）作用6 ～12 h后可見明顯的caspase-3，caspase-7，caspase-8和caspase-9剪切條帶（圖5）。 但在廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK的作用下，MOG誘導(dǎo)的caspase激活可以被完全抑制（圖6）。而且，在Z-VAD-FMK的作用下，MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也被完全抑制（圖7），提示MOG誘導(dǎo)caspase依賴性細(xì)胞凋亡。

圖5 MOG誘導(dǎo)的caspases活化Fig 5 MOG-inducing caspases activation

圖6 Z-VAD-FMK抑制MOG誘導(dǎo)的caspase-3/7活化Fig 6 Effect of inhibition by Z-VAD-FMK on MOG-inducing caspase-3/7 activation

圖7 Z-VAD-FMK阻斷MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡Fig 7 Effect of inhibition by Z-VAD-FMK on MOG-inducing apoptosis

2.5 NAC對MOG誘導(dǎo)△Ψm降低的 影響

用JC-1探針標(biāo)記△Ψm，觀察抗氧化劑NAC對MOG誘導(dǎo)的△Ψm降低的影響。如圖8所示，1.25 mmol·L-1NAC單獨作用不影響細(xì)胞△Ψm，而與10 μmol·L-1MOG共孵育HL-60細(xì)胞6 h則可以完全抑制MOG誘導(dǎo)的△Ψm降低。說明NAC對MOG誘導(dǎo)的△Ψm降低有明顯的抑制作用。而40 μmol·L-1Z-VAD-FMK與10 μmol·L-1MOG共孵育HL-60細(xì)胞6 h僅可部分抑制MOG誘導(dǎo)的△Ψm降低。

圖8 NAC對MOG誘導(dǎo)的△Ψm降低的影響 (n = 3)Fig 8 Effect of NAC on MOG-inducing △Ψm decrease (n = 3)

2.6 NAC對MOG誘導(dǎo)的caspase-3激活和細(xì)胞凋亡的影響

為評價細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的改變在MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，我們用Annexin V標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，熒光檢測caspase-3激活。結(jié)果如圖9所示，NAC（1.25 mmol·L-1）和/或MOG（10 μmol·L-1）處理HL-60細(xì)胞9 h后，NAC可以完全抑制MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及caspase-3激活。

圖9 NAC對MOG誘導(dǎo)的caspase-3激活和細(xì)胞凋亡的影響 (n = 3)Fig 9 Effect of NAC on MOG-inducing caspase-3 activation and apoptosis (n = 3)

3 討論

本研究通過觀察MOG對多種腫瘤細(xì)胞株的生長抑制能力、對HL-60細(xì)胞周期及凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，MOG能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生周期阻滯和凋亡并呈時間和劑量依賴性，說明此二萜化合物主要通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生抗腫瘤效果。

凋亡通路的激活是抗腫瘤藥殺滅腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵因素[6]。目前，化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的核心通路有配體或受體激活的caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路和線粒體依賴性細(xì)胞凋亡通路。Caspase依賴性細(xì)胞凋亡通路是指配基與受體結(jié)合，激活caspase-8，進(jìn)而激活caspase-3和PARP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；線粒體依賴性細(xì)胞凋亡是通過線粒體損傷引起的，包括線粒體膜通透性及膜電位變化、細(xì)胞色素c和其他凋亡因子的釋放等改變，最終也可以激活caspase-3和PARP導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7-8]。

本實驗中MOG可以引起caspase- 3/7的激活，同時MOG又可誘導(dǎo)時間依賴性線粒體膜電位降低，提示caspase通路激活及線粒體功能失調(diào)均參與MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。在廣譜caspase抑制劑Z-VADFMK的作用下，MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可以被完全抑制，說明MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡依賴于caspase通路的激活。而抗氧化劑NAC也可特異性抑制MOG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用，提示MOG引發(fā)細(xì)胞凋亡效應(yīng)與細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)失平衡有關(guān)。試驗觀察到外源性加入NAC可以抑制MOG引起的HL-60細(xì)胞增殖抑制，線粒體膜電位下降，caspase激活以及細(xì)胞凋亡，而caspase 廣譜抑制劑Z-VAD-FMK雖然能完全阻斷MOG誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，卻只能部分抑制△Ψm降低，因此我們推測MOG誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化還原失平衡是其介導(dǎo)凋亡效應(yīng)的啟動因素。進(jìn)一步研究表明，不同機制的抗氧化劑中僅有NAC和GSH可以抑制MOG誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞增殖抑制，提示細(xì)胞內(nèi)氧化還原失平衡可能由GSH水平降低引起，結(jié)合MOG和GSH的化學(xué)結(jié)構(gòu)特征，推測GSH很可能是MOG誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的細(xì)胞內(nèi)作用靶點，相關(guān)試驗仍在進(jìn)行中。

本課題通過對苞葉香茶菜庚素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡分子機制研究，初步探明了該二萜類化合物抗腫瘤作用可能的作用靶點及參與調(diào)節(jié)的信號傳遞途徑，研究結(jié)果可以為進(jìn)一步研究和開發(fā)能應(yīng)用于臨床的天然植物類抗腫瘤新藥提供實驗依據(jù)。

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