江 澤 ，許 華 ，李勝水 ，張鳳梅 ，李雙標(biāo) ，劉 巖

（1.河北省滄州市中心醫(yī)院，河北滄州 061001；2.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北滄州 061001）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，術(shù)后通常輔以放、化療。由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性，往往不同乳腺癌患者的癌細(xì)胞對同種藥物的敏感性是不同的。本實(shí)驗(yàn)采用3-(4,5)-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑藍(lán)（MTT）法體外進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞原代培養(yǎng)，檢測10種化療藥物對不同個(gè)體乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)，旨在探討該方法在篩選乳腺癌較敏感的藥物和指導(dǎo)臨床乳腺癌個(gè)體化治療中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 2004年11月～2006年12月乳腺癌根治標(biāo)本50例，其中，來自滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院22例，滄州市中心醫(yī)院12例，滄州市人民醫(yī)院5例，滄州市和平醫(yī)院3例，泊頭市醫(yī)院3例，青縣醫(yī)院2例，黃驊市醫(yī)院2例，東光縣中醫(yī)院1例?；颊呷繛榕?，年齡29～75歲，平均43歲。所有病例均為首次治療，術(shù)前未行放、化療，且經(jīng)術(shù)前穿刺活檢或術(shù)后病理證實(shí)。

1.1.2 儀器 MCD-15AC型CO2培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司產(chǎn)品），DNM-9600型酶標(biāo)分析儀（北京普朗公司產(chǎn)品），XDS-1B型倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠產(chǎn)品），BFX5-320型醫(yī)用低速離心機(jī)（浙江省白洋離心機(jī)廠產(chǎn)品），生物安全Ⅱ級實(shí)驗(yàn)室及Ⅱ級生物安全柜（河北省長風(fēng)凈化設(shè)備廠產(chǎn)品）。

1.1.3 主要試劑 RPMI 1640培養(yǎng)液，小牛血清，含10種化療藥物的微孔檢測板，MTT試劑，二甲基亞砜（DMSO），“腫瘤化療藥物敏感度檢測”MTT法試劑為泰倫生物科技（石家莊）有限公司產(chǎn)品（批號041025）。

1.1.4 抗癌藥物 阿霉素（ADM），長春瑞濱（NVB），順鉑（DDP），喜樹堿（HCPT），紫杉醇（PTX），5-氟尿嘧啶（5-FU），長春新堿（VCR），足葉乙苷（VP-16），甲氨蝶呤（MTX），絲裂霉素（MMC）。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤單細(xì)胞懸液的制備 無菌條件下切取直徑約1 cm大小的新鮮腫瘤組織，盡量去除脂肪及壞死組織，置RPMI 1640培養(yǎng)液中1 h內(nèi)送檢，并于2 h內(nèi)開始實(shí)驗(yàn)。在生物安全Ⅱ級實(shí)驗(yàn)室的Ⅱ級生物安全柜內(nèi)，用PBS液反復(fù)洗滌后去除腫瘤邊緣的纖維及脂肪組織，用眼科剪反復(fù)剪切成糊狀，用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾，并配制成2×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。

1.2.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 將預(yù)制檢測板從冰箱內(nèi)取出，平衡至室溫。將腫瘤細(xì)胞懸液均勻加入檢測板微孔中（每孔200 μl），每種藥物設(shè)2個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對照與調(diào)零孔，將檢測板置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT試劑20 μl，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng) 6～12 h，取出檢測板以 1000 r/min離心15 min，每孔加入DMSO 100 μl，充分振蕩直至微孔內(nèi)的紫色結(jié)晶全部溶解，用酶標(biāo)分析儀在570 nm處讀取各孔吸光度（A）值。

1.2.3 抑制率計(jì)算及判斷標(biāo)準(zhǔn) 按以下公式計(jì)算相對抑制率（IR）：相對抑制率（IR）=[1－（給藥孔平均 A 值/對照孔平均 A值）]×100%。根據(jù)計(jì)算出的IR值按以下標(biāo)準(zhǔn)判斷每種藥物的敏感度：IR>50%為高度敏感；30%≤IR≤50%為敏感；IR<30%為不敏感或耐藥。

2 結(jié)果

PTX、NVB、VP-16、5-FU、DDP 對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，敏感率為 74.0%～90.0%；VCR、ADM、MTX、MMC、HCPT 對乳腺癌細(xì)胞的抑制作用較弱，敏感率為58.0%～72.0%。見表1。

表1 10種化療藥物對50例乳腺癌腫瘤細(xì)胞藥敏檢測結(jié)果（例）

3 討論

MTT比色法的基本原理是：包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的有核細(xì)胞線粒體呼吸鏈上的琥珀酸脫氫酶，可將MTT還原成藍(lán)色的甲臜（formazan），其生成量與藥物作用后的細(xì)胞數(shù)目和（或）細(xì)胞活性呈正相關(guān)。20世紀(jì)80年代以后，有學(xué)將其用作評估藥物對腫瘤細(xì)胞殺傷效果的藥敏試驗(yàn)[1-3]，后經(jīng)逐步改良，應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞藥物敏感試驗(yàn)[4]。該法快捷、簡便、重復(fù)性好且無須放射性標(biāo)記，對腫瘤臨床化療方案的制訂具有一定的指導(dǎo)意義。

化療是乳腺癌患者重要的治療手段之一，然而不同個(gè)體乳腺癌細(xì)胞對抗癌藥物的敏感性存在差異。因此，乳腺癌聯(lián)合化療的個(gè)體化用藥日益受到關(guān)注。李勝水等[5]采用MTT法檢測了25例乳腺癌患者外周血淋巴細(xì)胞以及8例乳腺癌患者的組織癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，發(fā)現(xiàn)BCNU、PTX、ADM、MIT 4種藥物對兩種細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用MTT法對50例乳腺癌患者進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示各種抗癌藥物對受試乳腺癌細(xì)胞的敏感性順序?yàn)椋篜TX，NVB，VP-16，5-FU，DDP，VCR，ADM，MTX，MMC，HCPT。 結(jié)果顯示，抑制率在30%～50%的中度敏感病例所占比例較大，測試藥物對乳腺癌的敏感率以PTX最高，但其與NVB、VP-16、5-FU、DDP無顯著性差異，而比 VCR、ADM、MTX、MMC、HCPT 等 5 種藥物敏感率高（P<0.05），而后5種各藥物之間無顯著性差異（P>0.05）。此外，部分病例同時(shí)對多種藥物敏感，而有3例對10種藥物全部耐藥。黃小明等[6]比較了藥敏陽性與陰性組的化療效果，結(jié)果顯示體外藥物敏感性與臨床化療療效符合率為73.3%。徐建明等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對MTT敏感組的患者根據(jù)藥敏結(jié)果指導(dǎo)臨床化療，其療效明顯優(yōu)于憑經(jīng)驗(yàn)給藥的對照組及MTT耐藥組患者。MTT敏感組73例患者，根據(jù)藥敏結(jié)果，分別使用21種化療方案，與經(jīng)驗(yàn)對照組相比，方案的組成更靈活，治療更有針對性，療效也明顯提高，其中還不乏出現(xiàn)病理完全緩解（CR）的典型病例，同時(shí)認(rèn)為，該檢測方法的假耐藥可能性極小，臨床可參照耐藥結(jié)果，不再使用無效的化療藥物。此外，趙小華等[8]對MTT法藥敏結(jié)果與臨床療效進(jìn)行了對比分析，發(fā)現(xiàn)MTT法體外藥敏試驗(yàn)與乳腺癌總的預(yù)測準(zhǔn)確率為81.1%。由此說明，應(yīng)用MTT法檢測乳腺癌具有良好的敏感性，能反映藥物對癌細(xì)胞群的殺傷作用，與臨床相關(guān)性較好。

值得提出的是，該方法作為體外實(shí)驗(yàn)，分離培養(yǎng)的原代乳腺癌細(xì)胞由于脫離了正常人體環(huán)境，不能完全等同于體內(nèi)惡性腫瘤細(xì)胞，加之受試癌細(xì)胞在分離過程中的機(jī)械損傷、分離純化不充分而混有部分血細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等均可造成假陽性或假陰性結(jié)果，使得某些病例測試結(jié)果出現(xiàn)偏差。筆者采用汪波等[9]的方法，用網(wǎng)眼較大的篩網(wǎng)（200目）對腫瘤組織進(jìn)行過濾，制得的懸液主要由數(shù)個(gè)細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)組成，這樣可滿足腫瘤細(xì)胞對其他細(xì)胞的依耐性，減少對腫瘤細(xì)胞自泌活動(dòng)的影響，使腫瘤細(xì)胞的生長環(huán)境更接近體內(nèi)，從而提高M(jìn)TT體外藥敏試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。另外，細(xì)胞數(shù)量、孵育時(shí)間、試驗(yàn)藥物濃度、pH值等均可能影響試驗(yàn)結(jié)果。因此，不同的醫(yī)療科研單位仍需不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法和摸索適宜的實(shí)驗(yàn)條件，從而完善MTT法在腫瘤化療藥物敏感試驗(yàn)中的應(yīng)用，以期得到更可靠的結(jié)果。

[1]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Meth,1983,65(1-2):55-63.

[2]Kusumoto T,Sakaguchi Y,Machara Y,et al.Comparison of in vitro anticancer chemo sensitivity between human squamous cell carcinoma and adenocarcinoma[J].Oncology,1992,49:343.

[3]Singh B,Li R,Xu L,et al.Prediction of survival in patients with head and neck cancer using the histoculture drug response assay[J].Head Neck,2002,24(5):437-442.

[4]李勝水,李雙標(biāo),張風(fēng)梅,等.MTT法檢測胃癌患者腫瘤細(xì)胞對化療藥物敏感度的研究[J].現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008,6(23):43-44.

[5]李勝水,于翠珍,崔克勤,等.預(yù)制檢測板MTT法檢測癌患者外周血淋巴細(xì)胞化療藥物敏感性的研究[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2007,14(9):1182-1184.

[6]黃小明,蔣芹,李小民,等.MTT法指導(dǎo)乳癌化療的臨床研究[J].臨床腫瘤學(xué)雜志,2001,6(3):255-256.

[7]徐建明,宋三泰,湯仲明,等.MTT體外藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下的乳癌預(yù)見性化療[J].中華腫瘤學(xué)雜志,1997,19(2):153-156.

[8]趙小華,張為強(qiáng),蔣陽平,等.MTT法藥敏試驗(yàn)應(yīng)用于晚期乳腺癌[J].中國腫瘤,2003,12(8):479-481.

[9]汪波,張紅雨,黃巖,等.改良MTT藥敏分析在乳腺癌個(gè)體化治療中的意義[J].實(shí)用癌癥雜志,2004,19(2):184-185.