李 旭，李寶平

（山西醫(yī)科大學(xué)，山西太原 030001）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病，此病患病率和死亡率均高，可導(dǎo)致患者肺功能進(jìn)行性減退，嚴(yán)重影響其勞動(dòng)力和生活質(zhì)量，因此成為一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題。COPD與慢性支氣管炎和肺氣腫密切相關(guān)，而肺氣腫是指肺部終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端氣腔出現(xiàn)異常持久的擴(kuò)張，并伴有肺泡壁和細(xì)支氣管破壞而無(wú)明顯的纖維化[1]。因此，對(duì)肺氣腫的治療在COPD的治療中顯得尤為重要。目前研究認(rèn)為肺氣腫是一種不可逆轉(zhuǎn)的病理改變[2-4]，對(duì)此病尚無(wú)有效的根治方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是成體干細(xì)胞的一種，是一類多能干細(xì)胞，具有多向分化的潛能[5-6]，其多向分化的特性為我們治療不可逆病變提供了一種新的思路。本實(shí)驗(yàn)在用煙熏誘導(dǎo)大鼠肺氣腫形成后，觀察使用MSCs后的干預(yù)作用，為肺氣腫的治療提供參考和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

Wistar雌性大鼠 24 只，鼠齡 8 周，體重（180±20）g；Wistar雌鼠1只，鼠齡6周，體重約150 g（山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；4,6-二乙?；?2-苯基吲哚（DAPI，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；Anti-Pan-cytokeratin（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；羊抗兔IgG-Cy3（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 Wistar雌性大鼠24只隨機(jī)分為四組，每組6只，分別為健康組（A組）、模型組（B組）、生理鹽水對(duì)照組（C組）和治療組（D組）。B、C、D組均利用煙熏的方法誘導(dǎo)其肺氣腫的形成，之后D組給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療，C組給予生理鹽水作為對(duì)照，給藥4周后處死大鼠。

1.2.2 大鼠肺氣腫模型的制作 參照許三林等的方法自制大鼠實(shí)驗(yàn)性被動(dòng)吸煙裝置，將大鼠置于自制玻璃箱內(nèi)被動(dòng)吸煙，每次點(diǎn)燃香煙（金絲猴牌，寶雞卷煙廠制）10支，1次/d，持續(xù)30 min，每周6次，連續(xù)12周，12周后肺氣腫形成。

1.2.3 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 取6周齡Wistar雌鼠1只，采用無(wú)菌操作的方法，用咬骨鉗將股骨和脛骨兩骨端剪去，用PBS緩沖液將骨髓沖入離心管中，用吸管吹吸混勻。用比重為1.077 g/ml的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分離，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%～90%時(shí)進(jìn)行消化，以1∶2比例進(jìn)行傳代，擴(kuò)增培養(yǎng)[7]，通過多次傳代對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，取第3代細(xì)胞。

1.2.4 細(xì)胞標(biāo)記 取第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，加入無(wú)菌的DAPI至終濃度為50 g/L，在37℃條件下孵育30 min，離心后PBS反復(fù)洗滌以去除未結(jié)合的DAPI，離心收集細(xì)胞，稀釋至1×1010/L，放于冰浴中，1 h內(nèi)將細(xì)胞通過尾靜脈注射注入受體大鼠體內(nèi)。

1.2.5 肺組織病理標(biāo)本的制備 斷頸處死大鼠后，在胸部切斷肋骨，以暴露氣管、肺臟等，主支氣管切斷后用彎鉗將其提起，沿背部脊柱前方分離，將肺臟及心臟分離出來(lái)，剪去心臟后在25 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）壓力下經(jīng)氣管灌注10%中性甲醛溶液固定肺臟30 min，結(jié)扎氣管，浸入10%中性甲醛溶液，固定48 h，每只大鼠各取雙側(cè)最大橫徑處肺組織，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。

1.2.6 Pan-cytokeratin免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟后，將切片放入蒸餾水中，PBS洗3次，5 min/次，0.1 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）微波抗原修復(fù)，滴加5%BSA封閉液，加入 Anti-Pan-cytokeratin（稀釋比 1∶200，抗體稀釋液為 0.3%Triton X-100/PBS），4℃過夜，陰性對(duì)照組用PBS代替。加入羊抗兔 IgG-Cy3（稀釋比 1∶50）1∶100 稀釋，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡觀察熒光染色的結(jié)果并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺臟大體標(biāo)本觀察

健康組肺臟表面平整光滑，淡粉紅色，質(zhì)地較軟，彈性較好，指壓后無(wú)壓痕。模型組肺臟體積明顯增大，彈性較差，呈蒼白色，經(jīng)指壓后可留有壓痕，肺臟切面可見多量較大的肺泡腔，呈現(xiàn)不規(guī)則的形狀，且大小不一。D組和C組肺臟病變較B組輕。

2.2 肺組織病理學(xué)觀察

在顯微鏡下觀察HE染色后的病理切片。A組大鼠肺組織肺泡大小均勻，肺泡數(shù)目較多，肺泡間隔較厚。B組出現(xiàn)肺內(nèi)呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡等的擴(kuò)大，肺泡大小不一，肺泡數(shù)目明顯減少，肺泡間隔變窄，并有不同程度的斷裂。C組大鼠肺組織病理切片HE染色鏡下觀察，肺組織病理變化與B組相似，無(wú)明顯變化。D組大鼠肺組織病理切片HE染色鏡下觀察，肺泡數(shù)目較C組增多，肺泡面積減小，肺泡間隔增厚。

2.3 大鼠平均肺泡數(shù)（MNa）和平均肺泡面積（MAA）

在100倍顯微鏡條件下，觀察四組大鼠的肺臟病理切片，每只大鼠觀察2張片子，每張片子隨機(jī)選擇10個(gè)視野進(jìn)行肺泡計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的肺泡數(shù)（Na），測(cè)出每個(gè)視野的面積（TA），HE染色陽(yáng)性區(qū)域?yàn)榉螌?shí)質(zhì)的面積（PA），以MAA=（TA-PA）/Na計(jì)算每個(gè)視野的平均肺泡面積，測(cè)量時(shí)盡量避開支氣管及大、中血管。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠 MNa及MAA（）

表1 各組大鼠 MNa及MAA（）

與 D組比較，*P＜0.05

組別 大鼠只數(shù) MNa（個(gè)） MAA（μm2）A組664±6*44080±5078 B組631±7*102573±22783*C組633±4*90645±21715*D組646±564421±5223

經(jīng)方差分析，MNa四組總體上 F=11.164，P=0.001，MAA四組總體上F=8.603，P=0.002，說明四組總體上MNa與MAA均有顯著性差異。SNK-q檢驗(yàn)兩兩比較結(jié)果顯示，D組單位面積 MNa明顯高于 B 組（P＜0.05）和 C 組（P＜0.05），但明顯低于 A 組（P＜0.05），B 組和 C 組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。四組 MAA 比較：A、D 組無(wú)顯著性差異（P＞0.05），B、C 組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），D 組 MAA 明顯低于 B組（P＜0.05）和C組（P＜0.05）。結(jié)果表明，D組單位面積MNa明顯高于B組和C組，但仍低于A組；MAA明顯低于B組和C組。

2.4 注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的檢測(cè)

D組在熒光顯微鏡下，用DAPI標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以看見藍(lán)色的胞核，說明注射的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入肺組織中。此外，在肺組織中做Pan-cytokeratin免疫熒光染色，可見D組大鼠肺組織的肺泡壁、支氣管壁均有大量紅染的陽(yáng)性細(xì)胞，還可發(fā)現(xiàn)少量胞核為藍(lán)色的細(xì)胞，同時(shí)胞質(zhì)為紅色，提示供體來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在受體肺組織內(nèi)可分化為上皮細(xì)胞。見圖1～3（圖1～3為同一視野，箭頭所指為同一細(xì)胞）。

圖1 可見大鼠肺組織內(nèi)藍(lán)色的細(xì)胞核（DAPI標(biāo)記）（×200）

圖2 免疫熒光染色可見肺泡上皮細(xì)胞呈紅色（Cy3標(biāo)記）（×200）

圖3 在大鼠肺組織內(nèi)可見同時(shí)具有藍(lán)色胞核和紅色胞質(zhì)的細(xì)胞（×200）

3 結(jié)論

肺氣腫在臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性發(fā)展的不可逆的氣流受限，在病理學(xué)上表現(xiàn)為肺部終末細(xì)支氣管遠(yuǎn)端氣腔出現(xiàn)異常持久的擴(kuò)張，并伴有肺泡壁和細(xì)支氣管的破壞而無(wú)明顯纖維化的疾病，具有極高的死亡率和致殘率[8]。肺氣腫的內(nèi)科治療以預(yù)防感染、控制并發(fā)癥同時(shí)配合呼吸運(yùn)動(dòng)鍛煉來(lái)改善患者的呼吸功能，雖有一定的作用，但不能阻止病情發(fā)展。外科方面，肺移植術(shù)和肺減容術(shù)已成為治療終末期肺氣腫最有效的方法[9-11]，對(duì)于終末期肺氣腫而言，唯一有效的治療方法就是實(shí)行肺移植，但肺移植技術(shù)也有很大的局限性，如供體缺乏、價(jià)格昂貴等，所以無(wú)法廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為研究對(duì)象，就是因?yàn)殚g充質(zhì)干細(xì)胞是一類具有分化潛能的細(xì)胞，可以在特定條件下分化為多種細(xì)胞，它的損傷趨化性可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞“游”向損傷部位，并在局部微環(huán)境條件下誘導(dǎo)分化修復(fù)損傷部位。

制作肺氣腫模型的方法多種多樣，使用比較多的是彈性蛋白酶和香煙煙霧刺激的方法，使用彈性蛋白酶制作肺氣腫模型雖然周期短，但是由于液態(tài)的彈性蛋白酶混合液要在氣管內(nèi)彌散，通過大鼠的呼吸來(lái)進(jìn)行分布，所以不能均勻分布，以致肺氣腫的病變以及病變程度的分布都是不均勻的，與此相比，香煙煙霧的刺激能更好地模擬人類肺氣腫的發(fā)病情況[12]。因此，本實(shí)驗(yàn)采用煙熏來(lái)誘導(dǎo)大鼠肺氣腫的形成。

本實(shí)驗(yàn)在對(duì)四組病理切片進(jìn)行分析后，可以看到經(jīng)過骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療的大鼠單位面積MNa明顯高于B組和C組，MAA明顯小于B組和C組，說明肺氣腫的病理變化發(fā)生了改善，同時(shí)在熒光顯微鏡下我們看到DAPI標(biāo)記后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入了受損的肺組織，還發(fā)現(xiàn)其分化為上皮細(xì)胞，這些都說明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與了肺組織的再生。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在此過程中發(fā)揮了重要的作用，這就為治療肺氣腫提供了一條新思路。本實(shí)驗(yàn)只是一個(gè)初步的研究，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在這個(gè)過程中是否有其他作用，以及其分化的機(jī)制是什么，肺氣腫的病理變化是否能得到逆轉(zhuǎn)，都還需要進(jìn)一步研究。

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