吳 丹，滕偉禹

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧沈陽 110001）

腦出血是神經(jīng)系統(tǒng)常見病，出血后繼發(fā)性損害導致的神經(jīng)細胞死亡具有重要臨床意義，細胞凋亡（apoptosis）作為一種基因調(diào)控的細胞死亡方式可能為其中的一個重要環(huán)節(jié)。陳吉相等[1]研究發(fā)現(xiàn)，假手術組偶見凋亡細胞，表明正常腦組織一般不發(fā)生細胞凋亡；腦出血后凋亡細胞數(shù)明顯增多，據(jù)此認為，細胞凋亡是腦出血周圍組織損傷的一個標志，在一定程度上反映了其受損傷的程度。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）是一種廣泛存在、功能多樣的核轉(zhuǎn)錄因子，參與多種炎癥相關基因的表達和調(diào)控[2]。近年來的研究顯示，NF-κB在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在，可見于大腦皮質(zhì)、海馬和小腦突觸，神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞與血管內(nèi)皮細胞中均有表達[3]。目前關于腦出血后血腫周圍組織NF-κB表達的研究甚少。本實驗應用立體定向技術，將自體不凝血注入大鼠尾狀核制備腦出血模型，用TUNEL染色觀察神經(jīng)細胞凋亡，用免疫組化染色觀察NF-κB的表達，并初步探討腦出血后神經(jīng)細胞凋亡與NF-κB表達的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠45只，體重250～300 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。將大鼠隨機分為腦出血組和假手術組，分別按6 h、1 d、3 d、7 d分為4個亞組，每組5只；另設對照組5只。

1.1.2 試劑與器材

NF-κB/p65兔抗鼠多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；動物頭顱立體定位儀（SN-2，NARISHIGHE，日本）；微量注射器（上海激光醫(yī)學儀器廠）；電子分析天平（BP211D，賽多利斯，德國）；OLYMPUS光學顯微鏡（日本）；圖像分析儀（Metamorph Image System V4.6 VIC，美國）；紫外分光光度儀（UV300，Spestronic Unicam，美國）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦出血模型的制作

將大鼠用10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，用微量注射器從大鼠右側(cè)股動脈抽取70 μl血。在立體定位儀引導下將50 μl血緩慢注入右側(cè)尾狀核（前囟前0.2 mm，中線右旁3.0 mm處），進針6 mm，留針10 min后退針。假手術組注入50 μl生理鹽水，其他操作同實驗組。對照組不給予任何處置。術后觀察大鼠的行為改變，給水、給食飼養(yǎng)。根據(jù)實驗計劃在不同時間點將大鼠斷頭取腦。

1.2.2 標本的采集及檢測

在各時間點前15 min用過量水合氯醛麻醉大鼠后，開胸經(jīng)左心室插管至主動脈（0.5 min內(nèi)），依次灌注生理鹽水100 ml及4℃4%多聚甲醛溶液250 ml，斷頭取腦，固定于4%多聚甲醛溶液中持續(xù)12～24 h，然后進行酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋。

1.2.2.1 常規(guī)HE染色 切片常規(guī)脫蠟、水化，依次經(jīng)蘇木素染色、1%鹽酸酒精分化、返藍以及伊紅染色后進行脫水、透明、封片。光鏡下觀察，胞質(zhì)為紅色，胞核為藍色。

1.2.2.2 TUNEL染色 以TUNEL法檢測凋亡細胞。切片常規(guī)脫蠟、水化，滴加脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TDT）和地高辛標記的dUTP反應液，37℃孵育120 min；滴加生物素化抗地高辛抗體，37℃孵育30 min后DAB顯色，蘇木素復染，脫水、透明、封片。

1.2.2.3 NF-κB/p65免疫組化染色 用免疫組化SABC法檢測NF-κB/p65蛋白的表達。切片常規(guī)脫蠟、水化后行抗原熱修復，滴加 50 μl兔抗鼠多克隆 NF-κB/p65 抗體（1∶200），4℃過夜；然后滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫20 min；滴加SABC，室溫20 min。DAB顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片。

1.3 統(tǒng)計學處理

在400倍光鏡下觀察并隨機選擇血腫周圍5個不重復視野，計算陽性細胞積分光密度。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采用SPSS 13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗及Pearson相關分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HE染色

腦出血后6 h可見輕度腦水腫，血腫內(nèi)紅細胞形態(tài)完整。1 d可見腦水腫明顯，血腫周圍可見中性粒細胞及淋巴細胞浸潤，膠質(zhì)細胞開始增生。3 d時腦水腫最重，大量炎癥細胞浸潤，膠質(zhì)細胞增生明顯，大量神經(jīng)元變性壞死。7 d時血腫有所吸收，血腫周圍組織疏松，膠質(zhì)細胞及血管增生明顯。假手術組及對照組無明顯病理改變。見圖1。

圖1 腦出血后不同時間點HE染色（×400）

2.2 TUNEL染色

TUNEL染色陽性細胞是凋亡細胞，表現(xiàn)為核周染色質(zhì)濃縮的點狀深染棕褐色細胞。凋亡細胞在腦出血后6 h出現(xiàn)，1 d明顯增多，3 d達到高峰，此后逐漸減少，持續(xù)到7 d，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。凋亡細胞主要分布在腦出血周圍組織和同側(cè)大腦皮層。假手術組僅見及少量凋亡細胞。見表1、圖2。

表1 腦出血后不同時間點TUNEL陽性細胞表達（，積分光密度/HP）

表1 腦出血后不同時間點TUNEL陽性細胞表達（，積分光密度/HP）

與對照組比較，*P<0.05；與腦出血組6 h比較，#P<0.05

組別 時間6 h 1 d 3 d 7 d對照組（n=5）2.11±1.19---假手術組（n=5）5.12±0.736.39±2.138.48±3.738.42±1.75腦出血組（n=5）27.95±7.51*62.93±1.95*#88.59±4.91*#57.16±4.18*#

圖2 腦出血后不同時間點TUNEL陽性細胞的表達（×400）

2.3 NF-κB/p65免疫組化染色

腦出血周圍組織NF-κB/p65陽性細胞于術后6 h開始出現(xiàn)，1 d后逐漸增多，3 d達高峰，此后逐漸減少，持續(xù)到7 d仍高于對照組（P<0.05）。陽性表達部位為胞核，主要表達于神經(jīng)細胞和少量膠質(zhì)細胞。假手術組可見極少量陽性細胞。見表 2、圖 3。

表2 腦出血后NF-κB/p65蛋白表達（，積分光密度/HP）

表2 腦出血后NF-κB/p65蛋白表達（，積分光密度/HP）

與對照組比較，*P<0.05；與腦出血組6 h比較，#P<0.05

組別 時間6 h 1 d 3 d 7 d對照組（n=5）4.29±1.96---假手術組（n=5）12.67±3.5213.64±2.5818.84±3.9618.06±3.72腦出血組（n=5）30.31±3.97*#53.17±1.32*#88.37±8.67*#42.86±1.60*#

圖3 腦出血后不同時間點NF-κB/p65陽性細胞的表達（×400）

2.4 腦出血后神經(jīng)細胞凋亡與NF-κB/p65表達的相關性分析

腦出血后TUNEL表達與NF-κB/p65表達呈正相關（r=0.957，P<0.01）。

3 討論

凋亡即程序性死亡，是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)涉及正常發(fā)育、再生、增殖和病理變性的細胞死亡的主要方式[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血性腦組織的不同部位可見到神經(jīng)細胞凋亡[5-6]。本實驗結果顯示，凋亡細胞在腦出血后6 h出現(xiàn)，3 d達高峰，7 d時仍有少量表達，提示腦出血后存在細胞凋亡且呈動態(tài)性變化，據(jù)此推斷細胞凋亡是腦出血周圍組織損傷的一個重要標志。

NF-κB是一種廣泛存在、功能多樣的核轉(zhuǎn)錄因子，它在免疫、炎癥、細胞生長、分化、凋亡、癌變和個體發(fā)育等方面發(fā)揮著多種重要的生物學功能[7]。它由ReIA（p65）和p502個亞基以二聚體形式組成，僅p65含有激活轉(zhuǎn)錄的處理區(qū)[8]。已有研究證實，腦出血早期即有NF-κB表達，參與腦出血周圍組織繼發(fā)性損傷及腦水腫形成[9]。劉兵榮等[10]也研究發(fā)現(xiàn)NF-κB與腦出血后腦水腫有關。本實驗結果顯示，NF-κB/p65免疫組化陽性細胞于腦出血后6 h開始增多，1 d繼續(xù)上升，3 d達高峰，此后逐漸下降，持續(xù)到7 d仍高于對照組，并且NF-κB與TUNEL陽性細胞的表達變化呈正相關，這與劉宗超等[11]的實驗結果基本一致。大量研究證實，NF-κB具有促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞凋亡的作用，在創(chuàng)傷、腦缺血、阿爾茨海默病及帕金森病的神經(jīng)凋亡細胞內(nèi)可以觀察到NF-κB的激活[12-13]。由此推斷，NF-κB的激活可能是導致腦出血后神經(jīng)細胞凋亡的一個重要原因。

綜上所述，腦出血后存在細胞凋亡，且可能與NF-κB的激活有關。進一步研究其具體機制將為腦出血的治療提供新的思維空間。

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