張成義 邵世和 史玉玲 (江蘇大學基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院,鎮(zhèn)江212013)

長白山毛櫻桃在凍傷治療中的應用,屬于藥食同源,無明顯的毒副作用,且民間應用、經驗方及臨床小病例觀察,防治凍傷療效快速顯效,愈后不易復發(fā)。長白山毛櫻桃為長白山脈系植物果實,民間廣泛應用毛櫻桃泡酒防治凍傷,療效奇特,“櫻桃外用防治凍傷”在許多文獻中都有科普介紹[1,2]。但未見對櫻桃治療凍傷的系統(tǒng)研究記載。該實驗擬以民間用法為線索,通過液氮法建立兔耳及小鼠足凍傷炎癥模型,觀察毛櫻桃總黃酮(Prunus tomentosa thumb total flavone,PTTTF)的抗凍傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 普通級新西蘭大白兔12只,雌雄各半,2.0～2.5千克,兔耳大小厚薄相近,由吉林大學實驗動物中心提供,合格證:SCXK-(吉)2003-0003。昆明種小白鼠18～22克,雌雄兼用,由長春高新區(qū)醫(yī)學實驗動物中心提供,合格證:SCXK-(吉)2003-0004。

1.1.2 實驗耗材及儀器 毛櫻桃總黃酮(PTTTF),北華大學藥學院提供,為淡黃色粉末;冰醋酸,上海華聯(lián)制藥有限公司;-86℃超低溫冰箱(MDFU4086S型),日本SANYO公司;BS210S型電子分析天平,賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;WFJ2000型可見分光光度計,尤尼柯儀器有限公司;H?S11-Ni1型電熱恒溫水浴鍋,北京長安科學儀器廠;臺式低速LDZ4-0.8自動平衡微型離心機,北京醫(yī)用離心機廠;RB-200智能熱板儀,成都泰盟科技有限公司;微量移液器,法國Glison公司;生物攝像顯微鏡,Motic公司。

1.3 毛櫻桃總黃酮的制備 稱取鮮毛櫻桃500克洗凈搗爛,以1∶4體積比加入含1%鹽酸的75%乙醇,超聲頻率為40 kHz,提取40分鐘,回流提取2小時,減壓濃縮使含醇量達75%,然后避光4℃靜置12小時(蛋白質、多糖等沉淀除去),濾去沉淀,濾液置于旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至近干。將濃縮物混懸分散于水中,過濾去除不溶物,濾液裝聚酰胺柱[3],加聚酰胺30倍量的水洗脫,棄去洗脫液,再加90%乙醇洗脫,至洗脫液無色,收集洗脫液并減壓濃縮,將濃縮物真空冷凍干燥,即得PTTTF[4]。采用紫外波譜分析、鹽酸-鎂粉反應、三氯化鋁絡合反應、鉛鹽反應定性為黃酮類,采用HPLC,以蘆丁為對照品,測得冷凍干燥物中總黃酮含量為78.3%,折合生藥含總黃酮量0.61%。使用時現(xiàn)配制成相應濃度生理鹽水溶液并調節(jié)pH至近中性;外用配制成10 mg/ml,皮下注射配制成每5 ml含100、50和10mg溶液。

1.4 方法

1.4.1 動物的飼養(yǎng) 各組雌雄小鼠分籠飼養(yǎng),常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng),每只小鼠每天進食約5克,自由飲水;12小時自然光照,室溫控制在20℃～25℃,濕度為40%～60%。無菌墊料、飲水瓶定時更換,定時消毒。新西蘭大白兔在實驗室適應1周后開始實驗。

1.4.2 PTTTF對兔耳局部凍傷的影響[5]取新西蘭大白兔12只,用固定架固定露出頭部,將直徑25 mm鐵柱浸入-196℃液氮中,取出后立即將其緊貼于兔耳5秒,左右耳平行致凍傷,右耳作為自身對照。分兩組每組6只,分別為PTTTF組(10 mg/ml)和陽性對照組(0.025%醋酸去炎松軟膏組)。致傷后2小時開始給藥,各組分別用棉球涂抹左耳給藥每次0.5 ml,每天3次,連續(xù)給藥7天,每天記錄兔耳厚度(耳厚度測量:以螺旋測微器改制的耳厚度測量儀,測量耳凍傷局部表面覆蓋直徑為2 cm時的厚度)及局部凍傷變化情況,統(tǒng)計每組治療耳(左耳)與對照耳(右耳)厚度的差異性并計算耳腫脹抑制率,第7天給藥后30分鐘處死動物,切取實驗兔耳,10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,切片,HE染色,于光學顯微鏡下進行病理觀察。耳腫脹抑制率=

1.4.3 PTTTF對小鼠巴豆油耳腫脹的影響[6]選取昆明種健康小鼠50只,體重(18±2)克,隨機分為5組,每組10只,分為空白對照組,陽性對照組、PTTTF高劑量組(100 mg/kg)、PTTTF中劑量組(50 mg/kg)和PTTTF低劑量組(10 mg/kg)和PTTTF高、中、低劑量組小鼠每日一次,每次分別頸背部皮下注射(sc)PTTTF 5 ml/kg,空白對照組小鼠每日一次,每次頸背部皮下注射等量的生理鹽水,陽性對照組每日一次,每次頸背部皮下注射地塞米松磷酸鈉注射液(Dex)25 mg/kg,各組連續(xù)給藥7天,末次給藥后30分鐘,每只小鼠右耳廓兩面均勻涂抹2%巴豆油溶液(組成:巴豆油2%,乙醚78%,無水乙醇20%)0.05 ml,左耳不涂作自身空白對照。4小時后斷髓處死,剪下耳片,用8 mm打孔器打下雙側耳片,用電子天平分別稱重,以右耳片重量減去左耳重量所得的差值作為腫脹的程度并計算腫脹抑制率。耳腫脹度(mg)=右耳重(mg)-左耳重(mg),腫脹抑制率=

1.4.4 PTTTF對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響[7]選取昆明種健康小鼠50只,體重(18±22)克,分組方法及給藥同1.4.3,各組連續(xù)給藥7天,末次給藥后30分鐘由尾靜脈注射0.5%伊文斯蘭生理鹽水10 ml/kg,繼而腹腔注射0.6%冰醋酸10 ml/kg,20分鐘后將小鼠脫頸椎處死,用5 ml生理鹽水沖洗腹腔,輕揉腹部數(shù)分鐘,剪開腹腔,收集腹腔沖洗液放入試管中,1 000 r/min,離心5分鐘,移取上清用可見分光光度計測定吸光度(A590)值。

2 結果

2.1 PTTTF對兔耳局部凍傷的影響 以右耳作自身對照,造模后2小時可見每組家兔左右耳均紅腫,且左右耳腫脹程度無明顯差異(見圖1A1、B1),PTTTF組局部給藥第四天,可明顯抑制治療耳(左耳)炎癥局部毛細血管舒張、充血和水腫,而凍傷模型對照耳(右耳)炎癥局部毛細血管舒張、充血、水腫及青紫比較明顯,治療耳與對照耳比較,腫脹程度具有極顯著差異(P＜0.001),腫脹抑制率為26.84%(見圖1B4),較陽性對照組(見圖 1A4)腫脹抑制率為21.87%)治療作用明顯;給藥第七天,PTTTF組治療耳充血水腫基本消退,治療耳與對照耳比較,腫脹程度具有極顯著差異(P＜0.001),腫脹抑制率為32.52%(見圖1 B7、B7),較陽性對照組(腫脹抑制率29.68%)(見圖1 A7)治療作用更明顯(見表1),對兔耳輕、中度凍傷有顯著的治療作用。組織病理學可見:PTTTF組,對照耳光鏡下可見大量中性粒細胞滲出,紅細胞浸潤,組織疏松水腫,而治療耳鏡下中性粒細胞少量滲出,無明顯組織水腫;陽性對照組對照耳,光鏡下可見大量中性粒細胞滲出,紅細胞浸潤,組織疏松水腫,治療耳鏡下中性粒細胞少量滲出,組織水腫較輕(見圖2)。

2.2 PTTTF對小鼠巴豆油耳腫脹的影響 以耳腫脹度為觀測指標,與陰性對照組(15.26±3.22)比較,PTTTF 50 mg/kg(12.68±2.25)能明顯減輕巴豆油所致的小鼠耳腫脹(P＜0.05),腫脹抑制率為16.91%,PTTTF 100 mg/kg(11.41±2.44)顯著抑制巴豆油所致的小鼠耳腫脹(P＜0.01),抑制率達25.23%,并有劑量依賴趨勢,但作用弱于地塞米松組(10.33±1.82),抑制率32.31%(見圖3)。

2.3 PTTTF對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響 以腹腔滲出液A590為觀測指標,與陰性對照組(0.508±0.141)比較,PTTTF 10 mg/kg(0.446±0.066)對小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率為12.2%(P＞0.05),PTTTF 50 mg/kg(0.403±0.071)對小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率為20.67%(P＜0.05),PTTTF 100 mg/kg(0.317±0.085)對小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率為37.6%(P＜0.01),具有劑量依賴性,但作用弱于地塞米松組(0.191±0.055),小鼠腹腔毛細血管通透性抑制率為62.4%(P＜0.001,見圖4)。

圖1 PTTTF對兔耳液氮凍傷的治療效果Fig.1 The therapeutic effect of PTTTF on frostbite in the rabbit ears

表1 PTTTF對兔耳液氮凍傷模型的影響Tab.1 The effects of PTTTF on rabbit ear swelling by liquid nitrogen

圖2 PTTTF對兔耳液氮凍傷的病理學影響(×400)Fig.2 Pathologic effect of PTTTF on the rabbit's frostbite ears caused by liquid nitrogen(×400)

圖3 PTTTF對小鼠巴豆油耳腫脹的影響Fig.3 Effects of PTTTF on conton oil-induced ear edema in mice

3 討論

近年來,隨著地球環(huán)境的惡化,南方冬季大幅度轉冷,為了保障軍隊和廣大人民的寒季衛(wèi)生和防止大范圍人群突發(fā)性凍傷的發(fā)生,預防和治療凍傷已成為當前研究熱點,積極研究和開發(fā)有效抗凍傷藥,是對應全球近年來氣候環(huán)境惡化的當務之急。

圖4 PTTTF對醋酸所致小鼠腹腔毛細血管通透性增高的影響Fig.4 Effects of PTTTF on acetic acid-induced abdominal capillary hypermeability in mice

凍傷表現(xiàn)為免疫性炎癥反應,其病理過程錯綜復雜,其原因亦眾說不一,目前傾向于直接損傷,血液循環(huán)障礙,組織缺氧及炎癥反應的血管活性物質和毒性物質作用的綜合損傷學說[8,9]。局部組織在寒冷刺激下,凍傷區(qū)域的毛細血管早期收縮之后出現(xiàn)滲出,使組織出現(xiàn)水腫,發(fā)生炎癥性改變[10,11]。在光學顯微鏡下對凍傷兔耳組織形態(tài)學進行觀察,可見以下?lián)p傷變化:紅細胞及白細胞滲出,中性粒細胞增多,組織疏松,毛細血管擴張。這與凍傷后組織進行性缺血缺氧,炎性反應及酶系統(tǒng)的改變有一定的關系[12]。Serda等[13]研究發(fā)現(xiàn)局部組織凍傷早期水腫是因組織胺、5-羥色胺、緩激肽等損傷血管內皮引起的急性非特異性炎性反應。在損傷因子刺激較為強烈、組織損傷較為嚴重的情況下,常出現(xiàn)不同程度的全身反應,即發(fā)熱和白細胞增多等。

黃愛玲[14]、JIA等[15]通過研究發(fā)現(xiàn),黃酮類化合物具有多種生物學活性,尤其抗炎、免疫調節(jié)等作用已基本明確。通過民間應用“櫻桃泡酒治療凍傷有效”的經驗提示:其抗凍傷有效部位主要在醇提取物中。經本實驗證實毛櫻桃醇提物中總黃酮含量為78.3%,提示其主要活性成分為黃酮類。對液氮凍傷動物病理模型研究表明治療凍傷第四天,腫脹抑制率為26.84%,第七天,腫脹抑制率為32.52%,且作用強于醋酸去炎松軟膏,提示毛櫻桃總黃酮有較強的抗凍傷作用。通過小鼠巴豆油耳腫脹試驗和小鼠腹腔毛細血管通透性試驗證實毛櫻桃總黃酮可明顯抑制非特異性炎癥反應,而凍傷性炎癥為非特異性炎癥。通過對以上多種病理動物模型的藥效學觀察,充分驗證了PTTTF對凍傷的治療作用與民間應用效果相一致。由于PTTTF可降低毛細血管通透性及抑制非特異性炎癥反應,從而促進凍傷性炎癥的轉歸和組織修復,使損傷部位達到快速愈合,為凍傷的病理、病機研究及凍傷治療的天然藥物開發(fā)奠定了理論基礎。PTTTF治療凍傷的作用機制將有待于進一步研究。

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