曲恒怡

p53正向凋亡調(diào)控因子（PUMA）是p53下游的細胞凋亡促進因子[1,2]。最近研究提示，胰腺癌組織中PUMA表達缺失，PUMA表達缺失組織存在細胞凋亡的阻滯[3]，而增加細胞內(nèi)PUMA表達后，體外胰腺癌細胞的生長明顯被抑制[4]。因此，誘導或恢復細胞內(nèi)PUMA蛋白表達可能是胰腺癌治療的重要方法。

許多化療藥物的抗腫瘤作用是通過促進細胞凋亡實現(xiàn)的。吉西他濱是一類較新的抗細胞代謝類藥物，該藥可明顯改善胰腺癌患者癥狀、延長患者生存期，并已成為進展期胰腺癌的首選治療藥物[5,6]。 吉西他濱的一個作用是促凋亡效用，但其作用機制還不清楚。以前的研究發(fā)現(xiàn)，吉西他濱促進體外胰腺癌細胞凋亡的過程中伴隨著PUMA表達的明顯上調(diào)[7]。

本文研究吉西他濱能否對PUMA表達抑制后的胰腺癌細胞產(chǎn)生凋亡促進作用和生長抑制作用，旨在探討吉西他濱的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

Western blotting和RT-PCR試劑盒購自日本TaBaRa公司；PUMA抗體購于Cell Signaling公司；Hoechst 33258，MTT購自sigma。吉西他濱（生產(chǎn)廠家：ULLY FRANCE S.A，注冊證號H20020180）；RPMI1640培養(yǎng)基，小牛血清為Gibico公司產(chǎn)品；TUNEL檢測試劑盒，Lipofectamine 2000為北京中山生物公司產(chǎn)品。PcDNA3.1-PUMAAS和pcDNA3.1-真核表達載體由王新穎博士贈送（南方醫(yī)科大學消化病研究所）；該載體含有592bp PUMA cDNA，酶切位點位于BamH1和Xbal。

1.1.2 細胞株

胰腺癌細胞系A(chǔ)sPC-1購自中科院上海細胞所，細胞用含10%胎牛血清的RPMR1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)條件為37℃恒溫，飽和濕度和5%CO2，指數(shù)生長的細胞為實驗對象。

1.2 方法

1.2.1 基因轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定表達細胞株的篩選

AsPC-1細胞在含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。用0.25%的胰酶消化細胞后，按每孔4×104個細胞均勻加入96孔板中，培養(yǎng)至細胞85%～90%匯合后，分別轉(zhuǎn)染PcDNA3.1-PUMAAS和pcDNA3.1-質(zhì)粒，具體操作按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書進行。轉(zhuǎn)染24h后將細胞以1∶10比例傳代，次日開始用含有500μg/mLG418的培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)篩選3周，然后將獲得的細胞克隆，擴大培養(yǎng)。

1.2.2 MTT測定

收取指數(shù)生長期的AsPC-1細胞以及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PcDNA3.1-PUMAAS和pcDNA3.1-質(zhì)粒的AsPC-1細胞，0.25%胰蛋白酶消化后，用RPMI1640配成濃度為1×105/mL的細胞懸液，于96孔培養(yǎng)板每孔加100μL，37℃，5%CO2條件下孵育12h后，棄上清，于96孔培養(yǎng)板中分別加無血清164010μL為空白細胞對照。每孔分別加入10μL濃度分別為1、5、10和15μmol/mL吉西他濱，37℃，5%CO2條件下孵育1h后，每孔補加90μL10%1640，隨后分別于72h后每孔加MTT（5mg/mL）10μL，繼續(xù)孵育4h后加入溶解劑[10%SDS+1%HCl（1mol/L）]100μL/孔，于37℃至次日待甲 結(jié)晶完全溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測OD570值。以OD540值為縱坐標，時間（h）為橫坐標繪制生長曲線。并按抑制率=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值的公式計算細胞生長抑制。實驗重復3次，結(jié)果用±s表示，同時以非吉西他濱治療組對照。

1.2.3 流式細胞儀分析早期細胞凋亡率

分別收取吉西他濱處理72h后的實驗組和對照組的細胞，用pH 7.4的0.01mol/L PBS洗滌后，體積分數(shù)為70%冰乙醇4℃固定24h后，用流式細胞儀檢測亞G1 期出現(xiàn)凋亡峰（Ap峰）的細胞凋亡率。

1.2.4 Hoechst33258熒光染色法檢測細胞凋亡

接種細胞于6孔板中，每孔細胞約5×105，待細胞生長至適當密度時，1×PBS充分沖洗3次后，加入冰預冷的甲醇500μL/L，于冰上放置10min，再以1×PBS充分沖洗至少3次，1μmol/L Hoechst33258室溫染色10min，1×PBS充分沖洗3～5次。熒光顯微鏡可檢測到呈藍色的細胞核，凋亡小體顏色加深呈深藍色或形狀不規(guī)則。

1.2.5 TUNEL檢測晚期細胞凋亡

離心重懸各組細胞，調(diào)細胞數(shù)為1×108cells/L，接種細胞于內(nèi)置蓋玻片的3.5cm培養(yǎng)皿，37℃溫箱孵育24h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育72h，觀察細胞形態(tài)、照相，取出蓋玻片，采用TUNEL試劑盒，按試劑盒說明書操作，加入熒光素標記的脫氧核苷酸混合工作液，37℃孵育1h后采用493nm的藍光在熒光顯微鏡下觀察，計算每個高倍視野下凋亡細胞數(shù)，每一樣本隨機計數(shù)5個視野。觀察完畢繼續(xù)進行DAB顯色，封片。

1.2.6 Western Blot檢測蛋白的表達

提取細胞總蛋白進行Western Blot檢測：SDS-PAGE分離膠濃度為12%，積層膠濃度為5%，上樣量為15μg/L；SDS電泳：恒流，每塊板20～40mA，電泳時間約2h；轉(zhuǎn)膜：恒流，每張膜42mA，時間： 3.5h。

1.2.7 RT-PCR 檢測

按TRizol試劑盒（Invitrogen公司）說明書操作提取藥物作用72h的不同組細胞總RNA，取1μg RNA模按RT試劑盒（Takara公司）說明書反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。引物序列PUMA：R：5'-AGTCTG GGGAGACATGGGCTGG-3'F：5'-CAGCCATCCAGCACTGCCA TTC-3'（324bp），G3PDH（500bp）R：5'-TCCACCACCCTGT TGCTGTA-3' F：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'反應條件：50℃30min 94℃ 2min，94℃ 30s，55℃ 30s 72℃ 1min，72℃延伸7min，28循環(huán)。以上引物由賽百盛公司合成。取5μL 反應產(chǎn)物在含EB的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，用SYNGENE型凝膠成像系統(tǒng)照像，以目的基因條帶和內(nèi)參G3PDH條帶掃描峰下面積之比作為目的基因的相對表達量。試驗重復3次，數(shù)據(jù)以±s表示。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 MTT檢測

濃度分別為1、5、10和15mmo/L的吉西他濱10μL作用AsPC-1細胞72h后，對照組，pcDNA3.1-和pcDNA3.1-PUMAAS組細胞的生長抑制率見Fig1。吉西他濱抑制對照組，pcDNA3.1-空載體組細胞增殖，而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PUMAAS后的細胞生長不受影響，說明PUMA表達抑制后抑制吉西他濱引起的細胞生長。

2.2 FCM檢測

遞增濃度的吉西他濱作用對照組AsPC-1細胞72h后，細胞凋亡率逐漸增加，濃度為1mmol/L時，凋亡率為3.92±1.56，而濃度為15mmol/L時，凋亡率為27.82±1.42，吉西他濱有明顯的促凋亡效應，并與濃度有明顯的依賴性；pcDNA3.1組細胞凋亡率在濃度為1mmol/L時為4.2±1.46，而濃度為15mmol/L時，凋亡率為25.44±1.37，兩組相比差異無顯著性（P＞0.05）；pcDNA3.1-PUMAAS組AsPC-1細胞受到1、5、10和15mmo/L的吉西他濱作用后，細胞凋亡率分別為0.72±0.86、0.92±0.73、1.38±0.48、1.73±0.45，與對照組和pcDNA3.1-空載體組比，差異分別有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），與正常AsPC-1的凋亡率0.69±0.43比差異無顯著性（P＞0.05）說明PUMA表達抑制后抑制吉西他濱引起的細胞凋亡（Fig2）。

2.3 TUNEL檢測

吉西他濱作用對照組AsPC-1細胞72h后，玻片均可檢測到凋亡細胞，隨著濃度的增加，凋亡逐漸明顯。這些TUNEL陽性細胞呈現(xiàn)了凋亡的多態(tài)性特征，部分凋亡細胞核出現(xiàn)濃縮斷裂。15μmol/mL的吉西他濱作用72h后凋亡指數(shù)分別為10.74±2.3（Fig3.1A），而pcDNA3.1-PUMAAS組AsPC-1細胞在15μmol/mL的吉西他濱作用72h后，凋亡指數(shù)分別為1.2±0.93（Fig3.1B），兩組相比相比有顯著性差異P＜0.01）（Fig3.2），提示吉西他濱能誘導細胞凋亡，pcDNA3.1-PUMAAS轉(zhuǎn)染抑制吉西他濱引起的細胞凋亡。

Fig3.1 TUNEL analysis for AsPC-1 cells treated by Gemcitabine

2.4 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡程度

正常細胞核形態(tài)正常，而經(jīng)吉西他濱作用的AsPC-1細胞，用Hoechst 33258染色后顯示，細胞皺縮，體積變小，核固縮，核染色質(zhì)濃縮，凋亡小體，表面起泡（Fig4A），表明吉西他濱能夠誘導AsPC-1細胞凋亡，而pcDNA3.1-PUMAAS組AsPC-1細胞在吉西他濱作用下凋亡表現(xiàn)不明顯（Fig4B）。

2.5 吉西他濱對PUMA蛋白和PUMAmRNA表達的影響

Fig4 Hoechst staining for AsPC-1 cells treated by Gemcitabine

AsPC-1細胞給于濃度分別為1、5、10和15mmo/L的吉西他濱10μL作用72h后，PUMA蛋白和PUMA mRNA表達逐漸增加，在15mmo/L時表達量達到高峰。當AsPC-1轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PUMAAS 抑制PUMA表達后，吉西他濱誘導PUMA表達的作用消失（Fig5-6）。

3 討 論

PUMA是新近發(fā)現(xiàn)的Bcl-2家族BH-3亞家族中的成員，是p53的主要靶基因，可被內(nèi)外源野生型p53快速誘導。PUMA通過其下游Bax/Bak及Bcl-2/Bcl-xL相互作用，引起B(yǎng)ax活化、細胞色素C釋放及caspase級聯(lián)效應，導致細胞凋亡[1]。

Nakano等[2]證實轉(zhuǎn)染外源性PUMA基因可誘導細胞的快速凋亡和抑制集落形成，此外，轉(zhuǎn)染外源性PUMA基因還可增強細胞對化療的敏感性。Reimerta等[8]還發(fā)現(xiàn)，PUMA在線粒體應激誘導的凋亡中也是必須的。許多抗癌藥物引起腫瘤細胞凋亡與細胞中PUMA活化有關(guān)，例如，在給予抗癌藥物5-FU、DNA損傷劑多柔比星作用結(jié)腸癌細胞后，細胞中PUMA轉(zhuǎn)錄本明顯增高的同時可快速出現(xiàn)細胞凋亡[1]。

吉西他濱是一種新的類似5-FU的抗代謝類抗癌藥物，在臨床上應用廣泛，特別是在晚期胰腺癌治療中有著無可替代的重要作用。吉西他濱被細胞攝入后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚源x物，競爭性抑制DNA鏈的延長，導致DNA 片段形成和細胞死亡。

我們研究了吉西他濱對胰腺癌細胞增殖和凋亡的影響發(fā)現(xiàn)，吉西他濱明顯促進細胞凋亡，抑制細胞生長，并呈劑量依賴性。吉西他濱誘導腫瘤細胞凋亡的機制和途徑目前尚未完全明了。

在本實驗中，我們試圖研究了藥物作用與基因表達和凋亡的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PUMA表達隨藥物濃度的增加而升高，同時伴有細胞凋亡的進行性升高，當PUMA表達抑制后，吉西他濱誘導PUMA的現(xiàn)象消失，細胞凋亡水平也明顯下降，細胞生長不受到抑制，說明吉西他濱通過誘導PUMA表達而促進細胞凋亡。

我們的研究提示，PUMA是胰腺癌治療的新靶點，PUMA基因轉(zhuǎn)染并聯(lián)合化療藥物可能增強胰腺癌的治療效果。

[1]Yu J,Zhang L,Hwang PM.PUMA induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cell[J].Mol Cell,2001,256(7):671-682.

[2]Nakano K,Vousden KH.PUMA,a novel proapoptosis gene is induced by p53[J].Mol .Cell,2001,256(7):683-694.

[3]張克君,李德春,朱東明.PUMA蛋白在胰腺癌中的表達及臨床意義[J].世界華人消化雜志,2008,16(5): 488-492.

[4]張克君,李德春,朱新國,等.外源野生型p53正向細胞凋亡調(diào)控因子基因?qū)θ艘认侔┘毎L的作用[J].中華消化雜志,2006,26(11):778-779.

[5]Mimeault M. Recent advances on the molecular mechanisms involved in pancreatic cancer progression and therapies[J].Pancreas,2005,31(4):301-316.

[6]Westphal S.Apoptosis: targets in pancreatic cancer[J].Mol Cancer,2003,2:6.

[7]張克君,李德春,趙志莪.PUMA與c-myc在吉西他濱誘導胰腺癌細胞凋亡中的表達[J].蘇州大學學報(醫(yī)學版).2007,27(6):356-357.

[8]Reimerta C,Kogel D,Rami A.Gene expression during ER stressinduced apoptosis in neurona: induction of the BH3-only protein Bbc3/PUMA and activation of the mitochondrial apoptosis pathway[J]. J Cell Biol,2003,162(4):587-597.