康文藝， 劉瑜新， 宋艷麗， 張 麗

(河南大學(xué)中藥研究所，河南開封475004)

尼泊爾酸模(Rumex nepalensis Spreng.)為蓼科酸模屬植物，分布于河南、陜西、甘肅、青海、湖北、四川、云南和西藏等省。全草入藥，有清熱解毒、涼血止血之效［1］。尼泊爾酸模干燥根是貴州土大黃的植物來源［2］。文獻(xiàn)研究表明，尼泊爾酸模的研究報(bào)道很少，未見其化學(xué)成分研究報(bào)道。藥理研究表明，尼泊爾酸模根含活性蛋白-凝集素，能使3%兔紅血球發(fā)生凝集反應(yīng)［3］。Ghosh L.等在2002年和2003年連續(xù)報(bào)道了尼泊爾酸模根甲醇提取物具有瀉下和鎮(zhèn)靜作用［4-5］。

本文利用體外篩選模型對尼泊爾酸模根和地上部分的提取物進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗菌活性研究，以期為尼泊爾酸模開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

Multiskan MK3酶標(biāo)儀(美國Thermo Electron公司);LRH-150恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);DELTA 320型PH計(jì)(美國Mettler-Toledo公司);LRH-150生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);LDZX-30KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20);4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，026K1516);阿卡波糖(Acarbose，Lot 16869)和二甲亞砜(DMSO)均購自美國 Sigma公司。金黃色葡萄球菌(Staphlococcus aureus，SA)ATCC25923購買于上海天呈生物信息有限公司(批號TC-26)，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(Methcillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)和 ESBLs由河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院臨床分離得到，經(jīng)全自動(dòng)微生物分析儀VITEK-AMS鑒定，符合率99%。

尼泊爾酸模樣品于2007年11月采于河南省開封地區(qū)，經(jīng)河南大學(xué)中藥研究所生藥教研室李昌勤副教授鑒定為蓼科酸模屬植物尼泊爾酸模(R.nepalensis Spreng)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 提取

干燥的尼泊爾酸模根和地上部分粉碎，稱取30 g，石油醚浸泡12 h后，于索氏提取器中連續(xù)回流提取3次，每次1 h，得根石油醚提取物(RNRP)和地上部分石油醚提取物(RNAP)。揮干溶劑后，按上面的方法用乙酸乙酯提取，得尼泊爾酸模根乙酸乙酯提取物(RNRE)和地上部分提取物(RNAE)。揮干溶劑后，同樣方法甲醇提取，得甲醇提取物(RNRM和RNAM)。尼泊爾酸模不同溶劑提取物的得率見表1。

2.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性的篩選方法

以本課題建立的96微孔板篩選方法，405 nm處檢測其OD 值［6-8］。

尼泊爾酸模對α-葡萄糖苷酶抑制的動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

按照文獻(xiàn)［7］，分別加入不同濃度的底物(分別為10，5，2.5，1.25 mmol/L 和0.625 mmol/L)按照上述方法測定不同底物濃度下的反應(yīng)速度。同時(shí)測定不加抑制劑時(shí)不同底物濃度的反應(yīng)速度，分別繪制提取物的抑制作用動(dòng)力學(xué)曲線，確定抑制類型。

表1 尼泊爾酸模的α-葡萄糖苷酶抑制活性(n=3)

2.3 抗菌實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 抑菌圈的測定

按照文獻(xiàn)［9］的方法，用微量加樣器分別取5 μL樣品加到直徑6 mm的圓形濾紙片上，揮干溶劑后，置于含菌平板，同時(shí)用溶劑做空白對照。37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，記錄抑菌圈的大小。每份樣品平行操作3次，結(jié)果取平均值。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定

將出現(xiàn)抑菌圈的樣品進(jìn)行對半稀釋，按2.3.1項(xiàng)操作進(jìn)行，每個(gè)濃度平行操作3次，取平均值。用相應(yīng)溶劑作空白對照;出現(xiàn)抑菌圈的最低樣品濃度即為MIC值。所有操作均在無菌條件下進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 各提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性

對尼泊爾酸模根和地上部分的石油醚、乙酸乙酯和甲醇部分在相同濃度下(1.5 mg/mL)測定其α-葡萄糖苷酶的抑制活性(表1)。從表1可以看出尼泊爾酸模根和地上部分在濃度為1.5 mg/mL時(shí)各提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均較高(抑制率接近100%)，且均高于陽性對照藥阿卡波糖(68.43%)，表明尼泊爾酸模具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

為進(jìn)一步研究抑制活性，對尼泊爾酸模各提取物的初篩終濃度依次對半稀釋進(jìn)行IC50值計(jì)算(表1)。從表1可以看出，各提取物的 IC50值大小為:RNAE(2.13 μg/mL)、RNAM(2.13 μg/mL)、RNRE(3.83 μg/mL)、RNRM(22.5 μg/mL)、RNRP(36.01 μg/mL)和 RNAP(56.59 μg/mL)，遠(yuǎn)低于陽性對照 Acarbose(1081.27 μg/mL)。

不同溶劑比較，尼泊爾酸模的乙酸乙酯提取物的IC50值最小，顯示其抑制效果最好，其次為甲醇提取物，石油醚提取物的IC50值最大;不同部位比較，尼泊爾酸模地上部分的乙酸乙酯提取物抑制活性(IC50=2.13 μg/mL)和甲醇提取物抑制活性(IC50=2.13 μg/mL)較其根的同溶劑提取物抑制活性(IC50=23.83 μg/mL 和 22.50 μg/mL)高，但其石油醚提取物抑制活性(IC50=56.59 μg/mL)較根(IC50=36.01 μg/mL)的弱。說明尼泊爾酸模的地上部分是其主要的藥用部位。

3.2 提取物濃度對α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響

結(jié)果還顯示，尼泊爾酸模不同部位不同溶劑的提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性均呈劑量依賴性，其中地上部分石油醚提取物在終濃度小于0.2 mg/mL時(shí)達(dá)到最大抑制率100%，此后再增加提取物濃度抑制率不再變化，其他提取物在終濃度小于0.1 mg/mL時(shí)，其抑制率就達(dá)到了最大值100%，此后，再增加提取物濃度抑制率也不再變化。

3.3 酶抑制動(dòng)力學(xué)［10］

通過繪制抑制劑的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線(如圖1)，得到不加抑制劑時(shí)的α-葡萄糖糖苷酶的線性方程:y=14.218x+4.6123，求得其 Km=3.08 mmol/L，1/Vmax=4.6123。

根據(jù)文獻(xiàn)，由圖1可知尼泊爾酸模地上部分的乙酸乙酯提取物的抑制類型為非競爭性抑制類型，反應(yīng)速度Vmax隨著抑制劑濃度的增大而變小，米氏常數(shù)Km保持不變。并根據(jù)非競爭性抑制動(dòng)力學(xué)方程:1/V′max=1/Vmax(1+［I］/Ki)，求得尼泊爾酸模地上部分乙酸乙酯提取物濃度為2.93 mg/mL時(shí)，1/V′max=21.854，Ki=0.7837 μg/mL;濃度為1.46 mg/mL時(shí)，1/V′max=8.4754，Ki=0.7945 μg/mL。抑制劑濃度越大，Ki值越小，抑制愈強(qiáng)。而其甲醇部分則屬于混合型抑制類型，當(dāng)其濃度為 2.93 mg/mL 時(shí)，1/V′max=63.539，Km=0.888 μg/mL，當(dāng)其濃度為濃度為 1.46 mg/mL 時(shí)，1/V′max=11.4600，Km=1.6636 μg/mL，反應(yīng)速度 Vmax隨著抑制劑濃度的增大而變小，米氏常數(shù)Km也隨抑制劑濃度的增大而降低。

圖1 尼泊爾酸模地上部分乙酸乙酯提取物與甲醇提取物的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線

3.4 抗菌活性

研究尼泊爾酸模根和地上部分不同提取部位對金黃色葡萄球菌(SA)、耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)和β-內(nèi)酰胺酶陽性的金黃色葡萄球菌(ESBLs)的抑菌活性，結(jié)果顯示:其地上部分抑菌活性不明顯，根具有較好的抑菌活性(表2和表3)。

表2 尼泊爾酸模根提取物對各受試菌種的抑菌圈(樣品濃度均為0.25 mg/disc)

表3 尼泊爾酸模根提取物對受試菌種的MIC(mg/disc)

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，尼泊爾酸模根和地上部分的乙酸乙酯提取物具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性;尼泊爾酸模地上部分的乙酸乙酯部分的抑制類型為非競爭性抑制，其甲醇部分為混合型抑制。尼泊爾酸模根的抑菌活性較好，其活性部位為石油醚部位和乙酸乙酯部位。

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