陳世坤 胡建章 韓曉麗 徐國興

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IFN-γ在小鼠真菌性角膜炎中的表達

陳世坤 胡建章 韓曉麗 徐國興

福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科中心

目的：通過檢測IFN-γ及其轉錄因子T-bet在小鼠真菌性角膜炎中的表達水平，探討機體免疫在該病發(fā)展中的作用。 方法：應用角膜表層鏡法建立小鼠真菌性角膜炎模型，在感染后第1、3、5、7天，觀察角膜炎特點與病理變化；半定量RT-PCR和ELISA檢測角膜中IFN-γ的表達，半定量RT-PCR檢測T-bet的表達。結果：角膜接種菌液后，角膜浸潤混濁進行性加重；HE染色可見早期在角膜及前房中有大量的炎性細胞浸潤；RT-PCR與ELISA檢測結果表明，IFN-γ在角膜接種菌液后均出現(xiàn)表達，在第3天達最高值，而后逐漸降低；T-bet 在第3天達最高值；T-bet mRNA的表達與IFN-γ呈正相關(<0.05)。結論：在真菌性角膜炎中，Th1型免疫應答在調節(jié)機體的抗真菌免疫中發(fā)揮重要作用。

真菌性角膜炎 IFN-γ 免疫應答

已知致病性真菌侵入機體后，首先啟動非特異性免疫反應，TH1細胞分泌IL-12、IFN-γ等TH1型細胞因子，激活或提高吞噬細胞的抗真菌能力[1]。本研究通過建立Balb/c小鼠的真菌性角膜炎模型，觀察其臨床特征、病理特點的變化，檢測Th1細胞因子（IFN-γ）及其轉錄因子T-bet的表達，以探討Th1細胞應答在真菌性角膜炎發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型的建立

選用近交系Balb/c小鼠，6~8周齡；菌種選用標準茄病鐮刀菌，調整孢子接種濃度為1×106CFU/ml。采用表層鏡法建立小鼠真菌性角膜炎模型[2]。

1.2 潰瘍刮片鏡檢與培養(yǎng)。在拆除眼瞼縫線當天，隨機選取3只小鼠，刮取其角膜潰瘍灶，分別進行涂片查菌絲、真菌培養(yǎng)和細菌培養(yǎng)。

1.3 角膜炎形態(tài)觀察。角膜接種菌液后第1、3、5、7天，裂隙燈顯微鏡觀察角膜炎癥變化及其病變特點，如角膜混濁的面積、密度和表面的規(guī)則性等。

1.4 實驗取材及實驗室檢測。角膜接種菌液后第1、3、5、7天，自各組中隨機選取角膜感染成功的小鼠：（1）2只進行石蠟包埋，待行HE染色組織病理學檢查；（2）6只在分別待行Rt-PCR和ELISA檢測細胞因子的表達。

1.5 組織病理學檢查。角膜組織切片常規(guī)HE染色，光鏡下觀察角膜病理變化、炎癥細胞浸潤情況。

1.6 半定量RT-PCR檢測IFN-γ與T-bet 基因mRNA的表達。

1.7 ELISA檢測IFN-γ的表達。按照試劑盒步驟進行操作。

1.8 統(tǒng)計學處理。所有統(tǒng)計均在SPSS11.5軟件上運行，組內 或組間的比較采用檢驗或單因素方差分析（兩兩比較采用SNK法），T-bet mRNA與IFN-γ的關系采用直線相關回歸分析。以<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義的檢驗標準。

2 結果

2.1 潰瘍刮片鏡檢與培養(yǎng)

小鼠角膜潰瘍處刮片后采用10％KOH濕片法均可查見菌絲，真菌培養(yǎng)全部陽性，菌種鑒定均為原感染菌，細菌培養(yǎng)全部陰性。

2.2 角膜炎形態(tài)

接種菌液后第1天表現(xiàn)為角膜淺層輕度浸潤水腫；以后表淺浸潤加重，出現(xiàn)黃白色或灰黃色潰瘍灶；第7天角膜致密混濁，周邊角膜新生血管大量生長。

2.3 HE染色

接種菌液后第1、3天可見角膜基質及前房有大量的炎癥細胞浸潤，第5天炎癥細胞有所減少，周邊可見新生血管，角膜基質中纖維細胞逐漸增多。

2.4 角膜中IFN-γ的表達

RT-PCR及ELISA對角膜中IFN-γ的檢測結果表明，在正常角膜中幾乎未見表達，而角膜接種菌液后的第1、3天呈高表達，以后逐漸表達減弱。

2.5 角膜中T-bet基因mRNA的表達及其與IFN-γ的相關性

RT-PCR檢測結果表明，T-bet 基因mRNA在角膜接種菌液后開始表達，第3天達最高值，而后逐漸降低。

經(jīng)Pearson相關性分析結果顯示，在小鼠真菌性角膜炎發(fā)展過程中，角膜中T-bet 基因mRNA的表達與IFN-γ呈正相關(=0.645，<0.05)。

3 討論

已知， Thl細胞主要介導細胞免疫應答，引起前炎癥細胞因子（IL-12、IFN-γ，等）的產生，殺滅病原體，與保護性炎癥反應有關[3,4]。研究表明，IFN-γ主要由Thl型細胞和NK細胞產生，能促進吞噬細胞和Thl的增殖、活化[5]。本研究中，在角膜感染真菌后，迅速出現(xiàn)IFN-γ的表達，表明Thl型免疫應答積極參與調節(jié)機體的抗真菌免疫，且真菌性角膜炎的病程發(fā)展與抗真菌免疫平衡密切相關。

本研究顯示，IFN-γ在感染初期呈高表達，表明角膜感染真菌后，迅速啟動非特異性免疫反應，激活炎性細胞并分泌炎性因子以抵御真菌。在感染后第3天，IFN-γ表達達到最高，提示機體的免疫力可能達最強。此時角膜浸潤混濁正進行性加重，在角膜緣、角膜基質及前房中有大量的炎癥細胞浸潤，表明機體正處于急性感染期。隨著病程發(fā)展，IFN-γ水平逐漸降低，相對應的臨床表現(xiàn)是角膜中炎癥細胞逐漸減少，周邊大量新生血管生長。我們推測，Balb/c小鼠角膜感染真菌后，機體發(fā)生強烈的Th1型免疫應答，誘導炎癥反應的發(fā)生，以控制和清除真菌的感染。

T-bet是Thl細胞分化的特異性轉錄因子，能選擇性地表達于Thl細胞，與IFN-γ基因的啟動子區(qū)結合，正調節(jié)Thl型細胞因子，是決定Thl極性分化的關鍵因素[3]。T-bet的表達水平反應了Thl免疫水平。本研究中，T-bet 基因mRNA的表達與IFN-γ相一致，支持我們對小鼠角膜抗真菌免疫的推測。

[1] Cenci E, Mencacci A, Spaccapelo R,et al. T helper cell type 1 (Th1)- and Th2-like responses are present in mice with gastric candidiasis but protective immunity is associated with Th1 development[J]. J Infect Dis, 1995,171:1279-1288.

[2] Hu J, Wang Y, Xie L. Potential Role of Macrophages in Experimental Keratomycosis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2009,50:2087-2094.

[3] Szabo SJ, Sullivan BM, Stemmann C, et al. Distinct effects of T-bet in TH1 lineage commitment and IFN-gamma production in CD4 and CD8 T cells[J]. Science, 2002, 295(5553):338-342.

[4] Moser C, Jensen PO, Kobayashi O,et al. Improved outcome of chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection is associated with induction of a Th1-dominated cytokine response[J]. Clin Exp Immunol, 2002,127:206-213.

[5] Hino R, Shimauchi T, Tokura Y. Treatment with IFN-gamma increases serum levels of Th1 chemokines and decreases those of Th2 chemokines in patients with mycosis fungoides[J]. J Dermatol Sci, 2005,38:189-195.

福建省科技廳青年人才項目（2008F3041），福建醫(yī)科大學教授發(fā)展基金（2006-js6033；js09009），福建省衛(wèi)生廳青年科研基金（2007-2-1;2008-2-18）。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。