姜 荷，程坷偉，屠海云

(1.杭州市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)院，浙江 杭州 310019；2.維益食品(蘇州)有限公司，江蘇 蘇州 215021)

在休閑食品市場(chǎng)上，美味的牛肉干是深受大眾喜愛的食品，市場(chǎng)銷量逐年遞增，而且隨著我國(guó)肉制品行業(yè)的發(fā)展，休閑肉制品的發(fā)展也會(huì)越來越迅速[1-3]。但是在許多市場(chǎng)上口味和包裝都很出色的牛肉干在保質(zhì)期內(nèi)都會(huì)出現(xiàn)一定比例的霉變，本研究旨在分離鑒定導(dǎo)致牛肉干產(chǎn)品霉變的霉菌品種，并且根據(jù)該菌的生物學(xué)特性，指導(dǎo)工業(yè)生產(chǎn)采取適當(dāng)?shù)姆乐蚊棺兇胧?/p>

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛肉干霉變樣取自浙江某工廠留樣。

BX51T-32F01生物顯微鏡(帶數(shù)碼相機(jī)) 日本Olympus公司；L30ESEM型環(huán)境掃描電鏡 荷蘭Philips公司。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯-葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基、查氏(Czapek)培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、Czapek瓊脂培養(yǎng)基、Czapek酵母瓊脂培養(yǎng)基、麥芽(Wort)瓊脂培養(yǎng)基[4-5]，每種培養(yǎng)基(按質(zhì)量分?jǐn)?shù)配制)另加20%及40%蔗糖配成相應(yīng)的各種含蔗糖培養(yǎng)基。

1.3 方法

1.3.1 牛肉干產(chǎn)品霉變霉菌的分離

3種接種方法：1)在無菌接種箱內(nèi)，用接種環(huán)蘸取牛肉丁表面霉菌直接劃線接種于PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28～30℃培養(yǎng)5～7d；2)在無菌接種箱內(nèi)，挑取一小塊霉變牛肉丁在PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上方抖動(dòng)后，讓孢子掉落在培養(yǎng)基上，然后將牛肉丁置于培養(yǎng)基上，28～30℃培養(yǎng)5～7d；3)挑取一小塊霉變牛肉丁浸于無菌水中，洗落表面孢子，制成孢子懸液。用此孢子懸液10倍稀釋法，稀釋成10-2后劃線或涂皿分別接種于PDA培養(yǎng)基、Czapek培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，28～30℃培養(yǎng) 5～7d[6-10]。

配制含30%蔗糖或15%氯化鈉的Czapek培養(yǎng)基使用上述3種方法接種，然后分別置于30、37℃培養(yǎng)5～7d。配制含30%葡萄糖的PDA培養(yǎng)基使用上述3種方法接種，然后分別置于30、37℃培養(yǎng)5～7d。

1.3.2 牛肉干產(chǎn)品霉變霉菌的鑒定

霉變霉菌的培養(yǎng)[4]：將分離的霉菌純化后，三點(diǎn)接種于以上各種培養(yǎng)基上。在25～27℃分別培養(yǎng)3、5、7、1 0、1 4、2 1 d。

觀察霉菌表觀特征[11-14]：菌落形態(tài)、顏色；子實(shí)體形態(tài)特征：取樣制片，用顯微鏡觀察該霉菌子實(shí)體形態(tài)特征；掃描電鏡觀察其孢子表面結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌菌種的分離結(jié)果

通過在PDA培養(yǎng)基，Czapek培養(yǎng)基上的培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)樣品中的一種優(yōu)勢(shì)霉菌(編號(hào)2010-F1)為喜高滲透壓的霉菌，菌苔初期白色、淡綠色，后呈綠色，日久色深，橄欖綠，暗灰綠，分離收集后進(jìn)行菌種鑒定。

2.2 霉菌菌種的鑒定

2.2.1 表觀鑒定結(jié)果

優(yōu)勢(shì)霉菌2010-F1菌株在Czapek瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)極為局限，25℃培養(yǎng)14d肉眼只能見到一點(diǎn)灰白色的菌絲體及很少的正在形成的分生孢子結(jié)構(gòu)，菌落直徑3～5mm，結(jié)果見圖1。

圖1 2010-F1菌株在Czapek瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的菌落Fig.1 Colonies of 2010-F1 strain cultured in Czapek agar medium for 14 days

在Czapek酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)局限，25℃培養(yǎng)14d，直徑3mm，白色至淡白灰色，無滲出物；菌落反面淡黃色，見圖2。

圖2 2010-F1菌株在Czapek酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的菌落Fig.2 Colonies of 2010-F1 strain cultured in Czapek yeast-agar medium for 14 days

在含20%蔗糖的Czapek酵母膏瓊脂培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)14d，菌落藍(lán)綠色，中間突起，邊緣白色，直徑13mm，反面橄欖色，邊緣白色。優(yōu)勢(shì)霉菌2010-F1在含40%蔗糖的Czapek瓊脂培養(yǎng)基上，25～27℃培養(yǎng)14d菌落直徑可達(dá)15～20mm。中心稍突起，其他部分平坦，邊緣白色；質(zhì)地絲絨狀；具大量的分生孢子結(jié)構(gòu)，初期白色，后綠色；無滲出液；菌落反面呈不同程度的微黃到暗綠色，見圖3。

圖3 2010-F1菌株在40%蔗糖Czapek瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)14d的菌落Fig.3 Colonies of 2010-F1 strain cultured in Czapek agar medium with 40% sugar for 14 days

分生孢子頭幼時(shí)呈輻射狀，可達(dá)85μm或更長(zhǎng)；分生孢子梗多發(fā)生于基質(zhì)；孢梗莖(130～250)μm×(4～8)μm，壁平滑；頂囊燒瓶狀，直徑為9～16μm，1/2的表面可育；產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層；瓶梗(7～9)μm×(2～3)μm；分生孢子近球形，直徑為2.3～3.1μm，壁粗糙，表面凹突不平，見圖4～7。

圖4 霉菌2010-F1的分生孢子頭Fig.4 Conidial head of 2010-F1 strain

圖5 霉菌2010-F1的分生孢子Fig.5 Conidiophores of 2010-F1 strain

圖6 霉菌2010-F1的分生孢子表面結(jié)構(gòu)掃描電鏡照片F(xiàn)ig.6 Surface structure of 2010-F1 strain examined by scanning electron microscope

圖7 霉菌2010-F1的分生孢子頭掃描電鏡圖Fig.7 Conidiophores of 2010-F1 strain examined by scanning electron microscope

菌落在Wort瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)局限，25～27℃培養(yǎng)14d形成很少的分生孢子結(jié)構(gòu)，邊緣白色，無滲出液；無氣味；菌落反面無色。優(yōu)勢(shì)霉菌2007-F1在含20%、40%葡萄糖的PDA培養(yǎng)基上，菌落平坦，綠色，絮狀。優(yōu)勢(shì)霉菌2007-F1在以上培養(yǎng)基上，37℃不生長(zhǎng)。

2.2.2 分類鑒定結(jié)果

根據(jù)以上研究，2010-F1霉菌不具有有性型，適高滲透壓的培養(yǎng)特征和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)單層，分生孢子頭輻射狀的子實(shí)體形態(tài)特征，按照齊祖同[4]的分類系統(tǒng)，該菌屬于曲霉屬(Aspergillus)；曲霉亞屬(Subgen.Aspergillus)；又根據(jù)其分生孢子成熟時(shí)球形、近球形，少數(shù)橢圓形及其掃描電鏡表面結(jié)構(gòu)，可推斷其為帚狀曲霉(Aspergillus penicillioides)。

2.2.3 帚狀曲霉的生物學(xué)特性

經(jīng)鑒定，發(fā)霉牛肉干上的主要霉菌為帚狀曲霉，該菌特別嗜高滲透壓，只在干燥的基物上生長(zhǎng)，可見于室內(nèi)灰塵，人的皮膚，光學(xué)儀器的玻璃上等處，在很低的水分活度(aw0.75)下也能生長(zhǎng)，但是在水分活度0.7以下則生長(zhǎng)緩慢[15-17]。

3 討 論

帚狀曲霉常見于室內(nèi)灰塵，人體皮膚，因此在生產(chǎn)過程中，對(duì)牛肉干內(nèi)包車間的空氣凈化設(shè)備需要定期的進(jìn)行檢查，室內(nèi)的空氣潔凈等級(jí)需要定期的進(jìn)行測(cè)試，這樣可以保證室內(nèi)空氣的潔凈度，減少空氣帶入帚狀曲霉；對(duì)于內(nèi)包工人進(jìn)入內(nèi)包車間前的手部清洗要加大監(jiān)督管理的力度，確保不通過人體帶入霉菌，同時(shí)對(duì)工人的工作服要定期的進(jìn)行清洗，要做到不干凈的工作服不帶入車間，帽子和口罩要做到一次性使用結(jié)束要扔掉。原牛肉干的企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)是控制在水分活度0.75以下，而帚狀曲霉在0.75以下仍能生長(zhǎng)，在0.70以下其生長(zhǎng)才能受到抑制，這就解釋了為什么偶爾會(huì)出現(xiàn)霉菌生長(zhǎng)的現(xiàn)象。在生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)控制的時(shí)候應(yīng)該將水分活度控制在0.70以下，并對(duì)工藝進(jìn)行修改，這樣可以有效防止帚狀曲霉的生長(zhǎng)。

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