吳　溶，　崔莉鳳，　張　沖，　盧　珊

(北京工商大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院， 北京　100048)

水體富營養(yǎng)化不僅會(huì)引起水中藻類過度繁殖，影響景觀效果，甚至?xí)a(chǎn)生能引起魚類、家畜甚至人類中毒死亡的藻毒素[1]. 天然水體中的藻毒素含量低、干擾大、檢測(cè)困難，故對(duì)藻毒素提取分離進(jìn)行研究具有重要意義. 其中微囊藻毒素(Microcystins,MC)是一種環(huán)狀多肽，共軛雙鍵在238 nm下能獲得響應(yīng)，故可通過紫外檢測(cè)[2]. 由于自然界中MC常以痕量形式存在且干擾物質(zhì)較多，需結(jié)合固相萃取濃縮富集后方能進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)[3].

檢測(cè)MC常采用HPLC,但使用的流動(dòng)相及洗脫方式不同. 利用乙腈與水梯度洗脫可檢出MC-LR(MC同分異構(gòu)體之一，L、R分別代表亮氨酸和精氨酸)[4]. 但乙腈毒性大、價(jià)格高，考慮甲醇代替乙腈作為流動(dòng)相,且甲醇是較理想的雜質(zhì)和毒素洗脫液. 現(xiàn)有方法用20%甲醇淋洗，但對(duì)雜質(zhì)較多樣品效果不好[5]. 提取MC可采用超聲、固相萃取法. 研究指出,MC濃度隨超聲時(shí)間的延長而增加[6]，也有實(shí)驗(yàn)顯示超聲10 min，提取率即可達(dá)較高水平[7]. 本研究以純銅綠微囊藻為對(duì)象，比較藻毒素富集提取條件后建立分離、分析方法. 圓明園是北京重要景點(diǎn)之一，其水質(zhì)問題一直備受關(guān)注，但是否含有MC未見報(bào)道. 本研究利用所建立的方法對(duì)圓明園水樣進(jìn)行藻毒素的測(cè)定、分析.

1　實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

微囊藻毒素(MC-LR、MC-RR)標(biāo)準(zhǔn)樣品、三氟乙酸(色譜純)、甲醇(色譜純)，美國Fisher Scientific公司；Sep-pak C18小柱，美國Waters公司.

Waters-1505型高效液相色譜儀，美國Waters公司；KQ-400D型數(shù)控超聲裝置，昆山超聲儀器有限公司；3-18K型高速冷凍離心機(jī)，Sartorius公司；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；HH.SY11-Ni型電熱恒溫水浴鍋，北京長風(fēng)儀器公司.

純銅綠微囊藻取自清華大學(xué)環(huán)境工程實(shí)驗(yàn)室，編號(hào)FAKHB915，鏡檢銅綠微囊藻純度98%以上. 培養(yǎng)條件：環(huán)境溫度28℃，光強(qiáng)4 500 lx，光暗比12∶12，M-11培養(yǎng)基.

2　實(shí)驗(yàn)方法

2.1　液相條件確定的方法

采用HPLC對(duì)藻毒素進(jìn)行檢測(cè)分析. 從流動(dòng)相類型、配比、洗脫方式進(jìn)行比較，分析其分離度、峰形等，找出最佳液相條件. 比較甲醇與水、甲醇與磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相的效果及等度洗脫、梯度洗脫方式對(duì)檢測(cè)藻毒素的影響. 其他固定的液相條件：色譜柱溫度40℃,流速1 mL/min,檢測(cè)器紫外可見波長238 nm.

2.2　提取方法的優(yōu)化

取藻液、甲醇各10 mL，超聲后4℃，10 000 r/min離心10 min. 上清液過0.45 μm濾膜后以3 mL/min的流速通過活化后的C18小柱，取10 mL淋洗液，10 mL蒸餾水淋洗以去除其中的雜質(zhì). 抽掉空氣干燥2 min，10 mL洗脫液洗脫后60℃水浴蒸發(fā)至0.5～1.0 mL，甲醇定容至5 mL，-20 ℃保存待測(cè).

1)超聲時(shí)間的比較. 超聲時(shí)間為10，20，30，40 min藻毒素的提取效果.

2)淋洗液濃度的分析. 富集后的MC水溶液用體積濃度為10%，20%，30%的甲醇淋洗，比較淋洗液中雜質(zhì)、毒素及洗脫液中毒素的檢出效果.

3)洗脫液濃度的研究. 比較體積分?jǐn)?shù)為0.8，0.9，1.0的甲醇洗脫毒素的效果.

3　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1　液相條件的確定

3.1.1流動(dòng)相及流動(dòng)相配比的確定

1)流動(dòng)相為甲醇與水的混合. 比較以甲醇與水配比為80∶20；75∶25；70∶30；65∶35；60∶40；57∶43；50∶50作為流動(dòng)相時(shí)液相色譜圖，其中配比70∶30液相圖如圖1. 各配比條件下分離度如表1.

圖1　甲醇與水70∶30作為流動(dòng)相時(shí)液相色譜出峰時(shí)間1.099 min、1.739 min對(duì)應(yīng)的是MC-RR、MC-LR. Fig.1　HPLC chromatogram when methanol:water is 70∶30The bulge time of 1.099 min、1.739 min is MC-RR、MC-LR.

表1　甲醇與水的不同配比下的分離度Tab.1　Separability of different proportion　methanol and water

由圖1和表1可知，當(dāng)流動(dòng)相甲醇與水配比為70∶30時(shí),MC-LR與MC-RR能較好分開且峰形較理想,而其他配比條件分離效果不理想，峰形也較差. 但由于甲醇與水配比為70∶30時(shí)分離度僅有1.423，小于1.5，不能達(dá)到要求，原因可能是色譜柱未經(jīng)酸性改性，分離效果不理想. 文獻(xiàn)[8]指出，在流動(dòng)相中加入0.1%三氟乙酸或者磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)，可有效提高分離效果并優(yōu)化峰形.

2)甲醇與磷酸鹽緩沖溶液的混合. 由于甲醇與水作為流動(dòng)相時(shí)分離效果不太理想，嘗試用甲醇與磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)作為流動(dòng)相. 其中甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液為57∶43的液相圖如圖2. 各配比條件下的分離度如表2.

圖2　甲醇與磷酸鹽緩沖溶液液相色譜出峰時(shí)間3.604 min、6.354 min對(duì)應(yīng)的是MC-RR、MC-LR. Fig.2　HPLC chromatogram when used methanol and phosphate cushion solution The bulge time of 3.604 min、6.354 min is MC-RR、MC-LR.

表2　甲醇與磷酸鹽緩沖溶液不同配比下的分離度Tab.2　Separability of different proportion methanol and phosphate cushion solution

由圖2和表2看出，當(dāng)甲醇與磷酸鹽緩沖溶液配比為80∶20時(shí)， MC-LR與MC-RR并沒完全分離. 根據(jù)單標(biāo)樣分析可知，MC-LR和MC-RR出峰時(shí)間相近，可能有部分峰重疊，分離效果不佳. 當(dāng)甲醇與磷酸鹽緩沖溶液配比為57∶43時(shí),MC-LR與MC-RR能較好的分開，分離度達(dá)到最高4.532，且峰形較理想. 故使用甲醇與磷酸鹽緩沖溶液57∶43作為流動(dòng)相.

3.1.2洗脫方式的研究

選用等度、梯度洗脫兩種方式分析. 梯度洗脫方式指流動(dòng)相組成隨時(shí)間變化而變化，可獲得更好的分離度. 采用的梯度洗脫方法為0，10，35，40，45 min，甲醇∶磷酸鹽緩沖溶液分別設(shè)定為40∶55,50∶50,60∶40,60∶40,45∶55，液相色譜如圖3.

圖3　梯度洗脫液相色譜出峰時(shí)間8.742 min、19.375 min對(duì)應(yīng)的是MC-RR、MC-LR.Fig.3　HPLC chromatogram of grads elution The bulge time of 8.72 min、19.375 min is MC-RR、MC-LR.

由圖3可見，梯度洗脫的分離度可達(dá)12.446，比等度洗脫時(shí)分離度大很多，分離效果更理想. 比較圖2、圖3可明顯看出，等度洗脫MC出峰時(shí)間比梯度洗脫均早很多，且分離度也已達(dá)到要求，因此從時(shí)間與經(jīng)濟(jì)角度，選擇等度洗脫方式較為理想.

3.1.3藻毒素檢測(cè)方法的性能指標(biāo)

1)線性范圍和檢出限. 稱取微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品0.1 mg，100 μL甲醇溶解，純水定容至10 mL，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度為10 μg/mL，-20 ℃保存. 20%甲醇分別稀釋至約0，0.5，1.0，2.0，2.5，5.0 μg/mL. 進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)樣時(shí)間10 min. 按優(yōu)化后的色譜條件得出MC-LR與MC-RR的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4.

按3倍信噪比計(jì)算檢出限可達(dá)0.1 μg/mL，顯示0.1～5.0 μg/mL范圍內(nèi)均有良好的線性.

2)準(zhǔn)確度和精密度. 選用甲醇與磷酸鹽緩沖溶液57∶43作為流動(dòng)相，等度洗脫，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，紫外可見檢測(cè)器238 nm. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)以確定其性能指標(biāo). 具體數(shù)據(jù)如表3，其中準(zhǔn)確度、精密度用相對(duì)誤差、標(biāo)準(zhǔn)偏差表示.

3.2　提取方法的選擇

純銅綠微囊藻加入等量甲醇超聲進(jìn)行藻毒素的提取，超聲后過0.45 μm濾膜后固相萃取富集，60 ℃水浴濃縮定容待測(cè). 從超聲時(shí)間、淋洗液及洗脫液濃度方面優(yōu)化藻毒素的提取方法.

圖4　微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4　Standard curve of Microcystin

3.2.1超聲時(shí)間的比較

環(huán)狀結(jié)構(gòu)的微囊藻毒素性質(zhì)穩(wěn)定，超聲處理能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使胞內(nèi)的藻毒素釋放出來. 不同超聲時(shí)間的藻毒素提取率如圖5.

圖5　不同超聲時(shí)間的藻毒素提取率Fig.5　Extractions of different ultrasonic time

由圖5可以看出，超聲時(shí)間越長，MC的提取率越高，說明MC的提取效果隨著超聲時(shí)間的增長而提高. 當(dāng)超聲10 min后MC的提取率可高達(dá)84.51%. 30 min與40 min時(shí)提取率接近100%. 從而看出，超聲達(dá)到30 min，藻毒素基本提取出來，故選擇超聲時(shí)間為30 min，不僅藻毒素提取效果較好，且較節(jié)約時(shí)間.

表3　藻毒素檢測(cè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Tab.3　Determination result of Microcystin content

3.2.2淋洗液濃度的研究

收集不同濃度的淋洗液，檢測(cè)其中的雜質(zhì)和毒素. 其淋洗液液相色譜如圖6至圖8.

圖6　10%甲醇淋洗液的液相色譜Fig.6　HPLC chromatogram of the 10% CH3OH elution

圖7　20%甲醇淋洗液的液相色譜Fig.7　HPLC chromatogram of the 20% CH3OH elution

圖8　30%甲醇淋洗液的液相色譜Fig.8　HPLC chromatogram of the 30% CH3OH elution

比較圖6至圖8不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)30%甲醇淋洗時(shí)，有大量的藻毒素被洗脫下來，嚴(yán)重影響MC提取率. 當(dāng)用10%和20%甲醇淋洗時(shí)，去除雜質(zhì)效果均較好，且沒有洗脫出藻毒素. 故淋洗液可選用10%或20%的甲醇.

收集不同淋洗液處理后的藻毒素洗脫液，液相色譜如圖9至圖11.

圖9　10%甲醇洗脫液的液相色譜出峰時(shí)間6.491 min對(duì)應(yīng)的是MC-LR. Fig.9　HPLC chromatogram of 10% CH3OH washtion The bule time of 6.491 min is MC-LR.

圖10　20%甲醇洗脫液的液相色譜出峰時(shí)間6.481 min對(duì)應(yīng)的是MC-LR. Fig.10　HPLC chromatogram of 20% CH3OH washtion The bulge time of 6.481 min is MC-LR.

圖11　30%甲醇洗脫液的液相色譜Fig.11　HPLC chromatogram of 30% CH3OH washtion

由圖9至圖11可看出，當(dāng)淋洗液濃度為30%時(shí)，洗脫液中并無藻毒素，雜質(zhì)較多. 當(dāng)淋洗液濃度為10%和20%時(shí)，洗脫液中雜質(zhì)均較少，且明顯前者的洗脫液中MC含量高于后者. 所以，選擇淋洗液為10%的甲醇溶液更理想.

3.2.3洗脫液濃度的研究

不同濃度洗脫液的藻毒素提取率如圖12.

圖12　不同濃度洗脫液對(duì)藻毒素的提取率Fig.12　Extractions of different washtion concentration

圖12表明，洗脫液濃度越高，MC提取率越高. 當(dāng)洗脫液體積分?jǐn)?shù)為1.0時(shí)，提取效果最好，可達(dá)93.86%. 故選擇體積分?jǐn)?shù)為1.0的甲醇溶液作為洗脫液.

3.3　實(shí)際水樣MC檢測(cè)

圓明園作為北京城區(qū)一個(gè)重要景觀地區(qū)，水華問題較為嚴(yán)重. 尤其采用中水作為補(bǔ)充水源后，水中氮、磷含量較高，容易引發(fā)水華的暴發(fā). 本研究利用選定的藻毒素提取檢測(cè)方法，對(duì)圓明園海岳開襟景點(diǎn)的水樣進(jìn)行檢測(cè). 具體數(shù)據(jù)如表4.

表4　圓明園水樣藻毒素檢測(cè)結(jié)果Tab.4　Determination result of Microcystin content in Yuanmingyuan water　μg/L

表4數(shù)據(jù)顯示部分水樣可檢測(cè)到MC，說明此方法適用于實(shí)際水樣的測(cè)定. 圓明園水中藻毒素含量低于我國現(xiàn)頒布的生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范所要求的1 μg/L. 但比較各文獻(xiàn)報(bào)道的各地MC含量[9-10]，其MC含量處于相對(duì)偏高的水平，可能是由于圓明園補(bǔ)給中水后，水中所含氮元素較高. 氮素是MC主要構(gòu)成元素之一. 如MC-LR分子式為C49H74N10O12，氮含量為14%. 有研究表明，淡水中高含量的氮磷有助于產(chǎn)毒藻的生長和產(chǎn)毒[11]. 因此，圓明園水樣中較高含量的氮元素可能促進(jìn)藻毒素的產(chǎn)生，提高了水中MC的含量，具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究證實(shí).

為研究本實(shí)驗(yàn)方法用于實(shí)際水樣測(cè)量的可靠性，利用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察. 取一定量的實(shí)際水樣，用本實(shí)驗(yàn)提取方法濃縮至1 mL，照本實(shí)驗(yàn)液相條件檢測(cè)其中MC含量. 取1 mL藻毒素標(biāo)準(zhǔn)樣品加到實(shí)際水樣中，用同樣方法測(cè)定加入標(biāo)樣后的水樣所含MC含量，計(jì)算加標(biāo)回收率. 加標(biāo)回收進(jìn)行兩次做平行實(shí)驗(yàn). 其中加標(biāo)回收率= (加標(biāo)試樣測(cè)定值-試樣測(cè)定值)÷加標(biāo)量×100%. 其檢測(cè)結(jié)果平均值如表5.

由表5看出,MC-LR、MC-RR的平均回收率都能達(dá)到90%以上. 表明所建立的提取檢測(cè)方法可有效地檢測(cè)實(shí)際水樣中的藻毒素，且此方法數(shù)據(jù)可靠.

表5　加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)檢測(cè)值Tab.5　Determination result of join standard experiment

4　結(jié)　論

確定的藻毒素提取檢測(cè)方法如下：水樣超聲30 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液通過活化后的Sep-pak C18小柱富集. 先用10%的甲醇溶液淋洗，再用100%甲醇洗脫藻毒素，最后濃縮定容待測(cè). 藻毒素的檢測(cè)采用HPLC，甲醇與磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)按57∶43混合作為流動(dòng)相，等度洗脫分析MC. 此方法的準(zhǔn)確度對(duì)于MC-RR及MC-LR分別達(dá)到1.06%、2.17%，MC-RR、MC-LR的精密度為1.35%、0.42%. 本方法較GB/T 20466—2006水中藻毒素的測(cè)定方法，不僅節(jié)省藥品三氟乙酸的使用量，且在運(yùn)行時(shí)間上得以縮短，大大減少檢測(cè)成本.

將所確定的藻毒素提取檢測(cè)方法應(yīng)用于圓明園水樣，部分水樣可檢測(cè)出MC，質(zhì)量濃度為0.188～0.286 μg/L，加標(biāo)回收率可達(dá)到90%以上，適用于實(shí)際水樣的測(cè)定.