李志媛*馮 爽 張 立 李曉珉

結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查是診斷肺結(jié)核及判定療程的金標(biāo)準(zhǔn),快速有效的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn),也是結(jié)核病診斷的重要依據(jù)。利用噬菌體生物擴(kuò)增法（Pha B assay）快速檢測(cè)結(jié)核菌近年來(lái)在結(jié)核診斷研究中備受關(guān)注[1]。筆者采用Pha B法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本，均取得了理想結(jié)果，并與BACTEC-960法進(jìn)行對(duì)比，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）分枝桿菌菌株：結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV購(gòu)自北京結(jié)核病研究所，在L－J羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3周后，用生理鹽水洗下后研磨，采用麥?zhǔn)媳葷岱ū葷?，稀釋? g/L。（2）標(biāo)本來(lái)源：40例痰標(biāo)本取自我院2008年1月臨床確診為肺結(jié)核的住院患者深咳留取的合格痰標(biāo)本。（3）試劑盒：FAST Plaque TBTM結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑盒購(gòu)自上海金浩科技發(fā)展有限公司。BACTEC－960及其液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體法 按照FAST Plaque TBTM試劑盒說(shuō)明書配制所需試劑，包括痰處理液、培養(yǎng)基、瓊脂、噬菌體、敏感細(xì)胞等。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。（1）臨床標(biāo)本前處理：加等倍體積4%NaOH前處理液，渦旋震蕩混勻，20 min后，加入15 mL C液（FPTB增強(qiáng)培養(yǎng)基）。充分混勻，10 000 r/min，離心20 min棄去上清液。沉淀物加1 mL C液混勻，轉(zhuǎn)移0．5 mL至無(wú)菌反應(yīng)管中備用。（2）噬菌體浸染：取0.5 mL處理后的標(biāo)本加入反應(yīng)管中，加入0．1 mL噬菌體溶液充分混勻，使反應(yīng)管的內(nèi)壁完全濕潤(rùn)，以保證殺毒劑與噬菌體充分接觸，37℃孵育1 h。設(shè)置的陰性對(duì)照為反應(yīng)管中不加標(biāo)本，陽(yáng)性對(duì)照為反應(yīng)管中加入106稀釋的敏感細(xì)胞。（3）中止浸染：加入0．1 mL殺毒劑，充分混勻，室溫放置5 min后加入5 mL培養(yǎng)液和1 mL指示細(xì)胞。（4）澆注平皿與培養(yǎng)：上述混合培養(yǎng)液與5 mL溶解瓊脂液快速混勻后倒入無(wú)菌平皿中，待凝固成形，置于37℃培養(yǎng)18～24 h。（5）結(jié)果觀察：對(duì)于FAST Plaque TBTM質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果，陽(yáng)性及陰性對(duì)照應(yīng)該在如下范圍，陽(yáng)性對(duì)照≥20個(gè)噬菌斑，陰性對(duì)照≤10個(gè)噬菌斑。對(duì)于FAST Plaque TBTM標(biāo)本檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)該在如下范圍，陽(yáng)性結(jié)果≥20個(gè)噬菌斑，陰性結(jié)果≤19個(gè)噬菌斑。

1.2.2 BACTEC-960法檢測(cè) 按儀器與試劑說(shuō)明操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用Pha B法檢測(cè)為陽(yáng)性,在培養(yǎng)皿中可見到密布的噬菌斑。

2.2 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)40份肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本應(yīng)用Pha B法和BACTEC-960法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見表1。2種方法檢測(cè)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的陽(yáng)性率相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0．67，P＞0．05）。Pha B法與BACTEC－960法的陽(yáng)性符合率為84%（21/25），陰性符合率為86．7%（13/15），總符合率為85%（34/40）。

表1 Pha B法與BACTEC-960法檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

結(jié)核病細(xì)菌學(xué)快速檢查歷來(lái)是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。Wilson等在1997年開發(fā)了一種新的方法,利用裂解性噬菌體裂解分枝桿菌的特性來(lái)判斷結(jié)核桿菌的有無(wú),此法即為Pha B，基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌，未進(jìn)入感染菌體內(nèi)的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活，已進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。噬菌體在感染菌體內(nèi)大量增殖，并將菌體裂解，釋放出子代噬菌體可感染隨后加入的指示細(xì)胞，并將其裂解，在瓊脂平板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑。因此，只要根據(jù)噬菌斑的有無(wú)及其數(shù)量多少，即可判斷待檢標(biāo)本中是否存在活的結(jié)核分枝桿菌（MTB）或其他少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌（NTM）。

Albert等[2]曾在對(duì)噬菌體法研究中發(fā)現(xiàn)以L-J培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn),噬菌體法的靈敏度為70．3%，特異度為99．0%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值（PPV）和陰性預(yù)測(cè)值（NPV）分別為92%和95%；對(duì)涂陰組的694份標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度為48．8%，特異度為99．2%。龐茂銀等[3]在噬菌體法與Bactect-460培養(yǎng)的比較研究中發(fā)現(xiàn)兩者陽(yáng)性率無(wú)差異，兩者的陽(yáng)性符合率為82．9%，陰性符合率為73．7%，總符合率為80%。這些研究表明噬菌體法與L-J和Bactect-460培養(yǎng)法有很好的相關(guān)性，靈敏度和特異度均比涂片法要高。本文的研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論基本相近。筆者體會(huì)，噬菌體裂解法快速、簡(jiǎn)便，可以確定標(biāo)本中有無(wú)活的結(jié)核分枝桿菌，但在實(shí)際檢測(cè)中存在諸多影響因素，因而檢測(cè)結(jié)果并非絕對(duì)準(zhǔn)確，可作為結(jié)核病的初篩實(shí)驗(yàn)。

[1]呂斌,徐順清,陳志飛，等.用重組噬菌體檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,23(5):144-147.

[2]Albert H,Heydenrych N,Brookes R,et al.Performance of a rapid phage-basedtest,FastplaqueTB,todiagnosepulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Africa[J].Int J Tuberc Lung Dis,2002,6(6):529-537.

[3]龐茂銀,胡忠義,王奕峰,等.噬菌體裂解法與BACTECT460法在結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)中的比較[J].中華傳染病雜志,2003,21(1):27-29.