李志媛*馮 爽 張 立 李曉珉
結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢查是診斷肺結(jié)核及判定療程的金標(biāo)準(zhǔn),快速有效的細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn),也是結(jié)核病診斷的重要依據(jù)。利用噬菌體生物擴(kuò)增法(Pha B assay)快速檢測(cè)結(jié)核菌近年來(lái)在結(jié)核診斷研究中備受關(guān)注[1]。筆者采用Pha B法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本,均取得了理想結(jié)果,并與BACTEC-960法進(jìn)行對(duì)比,報(bào)告如下。
1.1 材料 (1)分枝桿菌菌株:結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV購(gòu)自北京結(jié)核病研究所,在L-J羅氏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3周后,用生理鹽水洗下后研磨,采用麥?zhǔn)媳葷岱ū葷?,稀釋? g/L。(2)標(biāo)本來(lái)源:40例痰標(biāo)本取自我院2008年1月臨床確診為肺結(jié)核的住院患者深咳留取的合格痰標(biāo)本。(3)試劑盒:FAST Plaque TBTM結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑盒購(gòu)自上海金浩科技發(fā)展有限公司。BACTEC-960及其液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司。
1.2 方法
1.2.1 噬菌體法 按照FAST Plaque TBTM試劑盒說(shuō)明書配制所需試劑,包括痰處理液、培養(yǎng)基、瓊脂、噬菌體、敏感細(xì)胞等。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。(1)臨床標(biāo)本前處理:加等倍體積4%NaOH前處理液,渦旋震蕩混勻,20 min后,加入15 mL C液(FPTB增強(qiáng)培養(yǎng)基)。充分混勻,10 000 r/min,離心20 min棄去上清液。沉淀物加1 mL C液混勻,轉(zhuǎn)移0.5 mL至無(wú)菌反應(yīng)管中備用。(2)噬菌體浸染:取0.5 mL處理后的標(biāo)本加入反應(yīng)管中,加入0.1 mL噬菌體溶液充分混勻,使反應(yīng)管的內(nèi)壁完全濕潤(rùn),以保證殺毒劑與噬菌體充分接觸,37℃孵育1 h。設(shè)置的陰性對(duì)照為反應(yīng)管中不加標(biāo)本,陽(yáng)性對(duì)照為反應(yīng)管中加入106稀釋的敏感細(xì)胞。(3)中止浸染:加入0.1 mL殺毒劑,充分混勻,室溫放置5 min后加入5 mL培養(yǎng)液和1 mL指示細(xì)胞。(4)澆注平皿與培養(yǎng):上述混合培養(yǎng)液與5 mL溶解瓊脂液快速混勻后倒入無(wú)菌平皿中,待凝固成形,置于37℃培養(yǎng)18~24 h。(5)結(jié)果觀察:對(duì)于FAST Plaque TBTM質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果,陽(yáng)性及陰性對(duì)照應(yīng)該在如下范圍,陽(yáng)性對(duì)照≥20個(gè)噬菌斑,陰性對(duì)照≤10個(gè)噬菌斑。對(duì)于FAST Plaque TBTM標(biāo)本檢測(cè),結(jié)果應(yīng)該在如下范圍,陽(yáng)性結(jié)果≥20個(gè)噬菌斑,陰性結(jié)果≤19個(gè)噬菌斑。
1.2.2 BACTEC-960法檢測(cè) 按儀器與試劑說(shuō)明操作。
1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)。
2.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv結(jié)核分枝桿菌應(yīng)用Pha B法檢測(cè)為陽(yáng)性,在培養(yǎng)皿中可見到密布的噬菌斑。
2.2 2種方法檢測(cè)結(jié)果比較 對(duì)40份肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本應(yīng)用Pha B法和BACTEC-960法進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表1。2種方法檢測(cè)肺結(jié)核患者痰標(biāo)本的陽(yáng)性率相近,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.67,P>0.05)。Pha B法與BACTEC-960法的陽(yáng)性符合率為84%(21/25),陰性符合率為86.7%(13/15),總符合率為85%(34/40)。
表1 Pha B法與BACTEC-960法檢測(cè)結(jié)果比較
結(jié)核病細(xì)菌學(xué)快速檢查歷來(lái)是國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的熱點(diǎn)。Wilson等在1997年開發(fā)了一種新的方法,利用裂解性噬菌體裂解分枝桿菌的特性來(lái)判斷結(jié)核桿菌的有無(wú),此法即為Pha B,基本原理是分枝桿菌噬菌體能感染活的分枝桿菌,未進(jìn)入感染菌體內(nèi)的噬菌體被隨后加入的殺毒劑滅活,已進(jìn)入菌體內(nèi)的噬菌體不受影響。噬菌體在感染菌體內(nèi)大量增殖,并將菌體裂解,釋放出子代噬菌體可感染隨后加入的指示細(xì)胞,并將其裂解,在瓊脂平板上出現(xiàn)透亮的噬菌斑。因此,只要根據(jù)噬菌斑的有無(wú)及其數(shù)量多少,即可判斷待檢標(biāo)本中是否存在活的結(jié)核分枝桿菌(MTB)或其他少數(shù)幾種非結(jié)核分枝桿菌(NTM)。
Albert等[2]曾在對(duì)噬菌體法研究中發(fā)現(xiàn)以L-J培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn),噬菌體法的靈敏度為70.3%,特異度為99.0%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值(NPV)分別為92%和95%;對(duì)涂陰組的694份標(biāo)本檢測(cè)的靈敏度為48.8%,特異度為99.2%。龐茂銀等[3]在噬菌體法與Bactect-460培養(yǎng)的比較研究中發(fā)現(xiàn)兩者陽(yáng)性率無(wú)差異,兩者的陽(yáng)性符合率為82.9%,陰性符合率為73.7%,總符合率為80%。這些研究表明噬菌體法與L-J和Bactect-460培養(yǎng)法有很好的相關(guān)性,靈敏度和特異度均比涂片法要高。本文的研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)論基本相近。筆者體會(huì),噬菌體裂解法快速、簡(jiǎn)便,可以確定標(biāo)本中有無(wú)活的結(jié)核分枝桿菌,但在實(shí)際檢測(cè)中存在諸多影響因素,因而檢測(cè)結(jié)果并非絕對(duì)準(zhǔn)確,可作為結(jié)核病的初篩實(shí)驗(yàn)。
[1]呂斌,徐順清,陳志飛,等.用重組噬菌體檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2000,23(5):144-147.
[2]Albert H,Heydenrych N,Brookes R,et al.Performance of a rapid phage-basedtest,FastplaqueTB,todiagnosepulmonary tuberculosis from sputum specimens in South Africa[J].Int J Tuberc Lung Dis,2002,6(6):529-537.
[3]龐茂銀,胡忠義,王奕峰,等.噬菌體裂解法與BACTECT460法在結(jié)核分枝桿菌快速檢測(cè)中的比較[J].中華傳染病雜志,2003,21(1):27-29.