皮淑芳 邸阜生 王懷禎 王 禹 李 鑫

胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是機體組織或靶細胞對胰島素的作用缺乏正常反應,其敏感性和反應性降低的一種代謝狀態(tài)[1]。IR能夠引起肥胖、高脂血癥、高血壓、糖尿病等多種疾病。近年研究發(fā)現(xiàn)IR可使血小板活化，表現(xiàn)為血小板黏附率、聚集率增加，易于血栓形成。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3-K）是血小板活化信號傳導通路中的關(guān)鍵酶，本研究旨在探討IR對血小板內(nèi)PI3-K活性的影響，進一步明確IR導致血小板活化的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 德國比格犬24只，雌雄不拘，月齡8～10個月，平均體質(zhì)量（10．8±1．2）kg，購于軍事醫(yī)學科學院實驗動物基地。

1.2 試劑與儀器PI3-K多抗、堿性磷酸酶二抗購自北京中山試劑公司，Satacruz公司生產(chǎn)；血小板激活劑（ADP，20 μmol/L，美國Biopool公司）；聚集儀（LBY-NJ2型,北京普利生）；黏附儀（中國醫(yī)學科學院血液學研究所）；流式細胞儀（FACSort Calibur型,美國Becton Dickion公司）；微量泵（SP-100 s型，JMS公司）；蠕動泵（DDB-320型，上海之信儀器有限公司）。

1.3 造模與分組24只動物隨機分為2組：對照組12只，普通喂養(yǎng)，于每天08:00、16:00給予常規(guī)膨化飼料（購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心）投喂。每100 g飼料含粗蛋白28.2 g，脂肪3.6 g。每只動物每日進食約400 g，攝入總熱量65 kcal/kg（1 kcal=4.184 0 kJ），其中蛋白及碳水化合物占81%，脂肪占19%；實驗組12只，給予高脂喂養(yǎng)，擬建立IR動物模型[2]，每1 000 g常規(guī)實驗室飼料增加熟牛油150 g，每只動物每天進食約500 g，攝入總熱量156 kcal/kg，其中蛋白及碳水化合物占47%，脂肪占53%。2組動物喂養(yǎng)6個月后進行正常血糖-高胰島素鉗夾試驗，確認其是否存在IR[3]，實驗以葡萄糖輸注速度（glucose infusion rate，GIR）表示，輸注速度慢，說明胰島素降低血糖的有效性減低，可以認定機體存在IR。

1.4 檢測指標2組動物喂養(yǎng)6個月后取清晨空腹靜脈血,測定相關(guān)指標：體質(zhì)量（BM）、空腹血糖（FPG）、空腹胰島素（FINS）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血小板黏附率（玻球法）、血小板聚集率（比濁法）。以血小板黏附率、聚集率反映血小板活化狀態(tài)。其中血小板內(nèi)PI3-K活性測定采用流式細胞儀分析技術(shù)，方法為：PI3-K多抗10 μL，加入動物靜脈血標本10 μL，37℃溫育30 min，加入堿性磷酸酶標記二抗4 μL，溫育30 min，流式細胞儀測定結(jié)果,PI3-K表達百分率即代表PI3-K活性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組動物相關(guān)代謝指標及正常血糖-高胰島素鉗夾試驗 實驗組動物高脂喂養(yǎng)6個月后，BM、TC、TG、FPG、FINS均明顯高于對照組，GIR低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），實驗組動物存在IR，見表1。

表1 2組動物相關(guān)代謝指標及正常血糖-高胰島素鉗夾試驗結(jié)果比較 （n＝12±s）

表1 2組動物相關(guān)代謝指標及正常血糖-高胰島素鉗夾試驗結(jié)果比較 （n＝12±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

對照組實驗組t BM（kg）10.43±1.33 13.69±1.41 4.11**TC(mmol/L)4.57±0.62 5.84±0.73 3.97**TG（mmol/L）0.51±0.07 0.78±0.06 6.12**FPG（mmol/L）4.82±0.89 5.51±0.62 2.20*FINS(IU/L)1.29±0.28 2.49±0.28 1.53**GIR［mg/（kg·min）］5.42±0.89 3.39±0.55 6.75**組別

2.2 2組動物血小板黏附率、聚集率及PI3-K活性結(jié)果比較 實驗組動物的血小板黏附率、聚集率、PI3-K活性明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表2 血小板黏附率、聚集率、PI3-K活性結(jié)果比較（%±s）

表2 血小板黏附率、聚集率、PI3-K活性結(jié)果比較（%±s）

*P＜0．05，**P＜0．01

組別對照組實驗組t PI3-K 57.19±4.17 61.02±2.67 2.68*黏附率34.83+4.76 48.16+7.63 5.14**聚集率23.83+5.65 33.67+6.53 5.5**

3 討論

目前建立IR動物模型最常用的方法為高脂喂養(yǎng)，高脂血癥造成IR的中心環(huán)節(jié)是脂肪細胞產(chǎn)生前炎癥細胞因子，分泌過量的腫瘤壞死因子α、游離脂肪酸、白介素-6等，這些物質(zhì)引起機體氧化應激反應，產(chǎn)生活性氧，干擾細胞胰島素信號傳導，導致IR。本研究中，實驗組動物高脂喂養(yǎng)半年后經(jīng)正常葡萄糖-高胰島素鉗夾試驗確認存在胰島素抵抗，證實了高脂喂養(yǎng)方法建立IR動物模型的有效性。

本研究實驗組動物血小板黏附率、聚集率高于對照組，提示IR可以引起血小板活化，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[4-5]。目前研究認為血小板的活化是通過磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-一氧化氮-環(huán)一磷酸鳥苷（PI3-K-AKT-NO-cGMP）這一信號途徑實現(xiàn)[6-7]。這一理論指出血小板活化過程中PI3-K首先活化Akt，再經(jīng)過NO-cGMP信號途徑調(diào)節(jié)血小板活化反應。PI3-K的最終作用底物是來自膜磷脂的磷脂酰肌醇（PtdIns）,催化其肌醇環(huán)上的第3位羥基磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸[PtdIns（3，4）P2]和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸[PtdIns（3，4，5）P3]，它們定位于血小板膜骨架蛋白，使血小板膜糖蛋白GPIIb/IIIa形成復合體分布于血小板膜表面，并暴露纖維蛋白原結(jié)合位點，使血小板活化，發(fā)生黏附、聚集反應。PtdIns（3，4，5）P3還可以調(diào)節(jié)血小板內(nèi)激酶活性引起血小板釋放反應[6]，將貯存在致密體、α-顆?；蛉苊阁w內(nèi)的二磷酸腺苷（ADP）、三磷酸腺苷（ATP）、5-羥色胺、Ca2+等許多物質(zhì)釋放，這些物質(zhì)是強烈的血小板激活劑，使血小板反應迅速放大，引起血小板活化的正反饋。因此PI3-K對于血小板活化具有重要意義。本研究中實驗組動物PI3-K表達增加，說明IR可以引起PI3-K活性增強，即在IR狀態(tài)下血小板內(nèi)PI3-K-AKT-NO-cGMP信號途徑處于活躍狀態(tài)，引起血小板活化，這與實驗得出的存在IR的動物血小板黏附率、聚集率增高的結(jié)果相符合。

目前關(guān)于IR對PI3-K活性影響的相關(guān)研究尚少，對血小板內(nèi)PI3-K活性有直接影響的是血小板膜流動性的改變。本研究中IR動物存在體質(zhì)量增加、高血脂、高血糖、高胰島素血癥等多種代謝紊亂，與相關(guān)研究結(jié)果一致[8]。其中，高血糖可以通過糖基化終產(chǎn)物減弱血小板的膜流動性，這種改變作為一種物理信號引起血小板內(nèi)非受體性酪氨酸激酶的激活，并進一步激活PI3-K，但在IR引起的其他代謝異常中，還有哪些因素可以引起PI3-K活性改變，尚有待進一步研究。

[1]儲毓舜,梁靜,張成,等.胰島素抵抗與冠心病危險因素的相關(guān)性分析[J].天津醫(yī)藥,2008,36(6):427-429.

[2]田愛平,郭賽珊,申竹芳.高脂飼料與胰島素抵抗動物模型[J].中國藥理學通報,2006,22(3):267-269.

[3]DeFronzo RA,Tobin JD,Andres R.Glucose clamp technique:a method for the quantifying insulin secretion and resistance[J].Am J Physiol，1979，237(3):214-223.

[4]Stefania B,Giovanni P,Maria TG,et al.Insulin resistanceas a determinant of platelet activation in obese women[J].J Am Coll Cardiol,2006,48(11):2531-2538.

[5]Schneider DJ.Factors contributing to increased platelet reactivity in people with diabetes[J].Diabetes Care,2009,32(4):525-527.

[6]Stojanovic A,Marjanovic JA,Brovkovych VM,et al.A phosphoinositide 3-kinase-AKT-nitric oxide-cGMP signaling pathway in stimulating platelet secretion and aggregation[J].J Biol Chem,2006,281(24):16333-16339.

[7]Randriamboavonjy V,Fleming I.Insulin,insulin resistance,and platelet signaling in diabetes[J].Diabetes Care,2009,32(3):528-530.

[8]Lusha X,Jennifer D,Cory C,et al.Insulin resistance and impaired functional vasodilation in obese Zucker rats[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008，294（4）:1658-1666.