張 臣 李 彤 侯躍龍 嚴曉曄 高英堂

人的內(nèi)皮細胞是血管壁的主要組成部分，在維持組織穩(wěn)態(tài)、纖溶與凝血、血液組織交換、血管舒縮調(diào)節(jié)、血管新生、血細胞激活和遷移等生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用，另外在免疫反應(yīng)起始過程中也起著決定性的作用[1]。因此體外獲得血管內(nèi)皮細胞可為闡明許多疾病血管并發(fā)癥的病理過程提供重要研究模型[2]。新生兒臍帶由于取材經(jīng)濟、來源充足,而成為血管內(nèi)皮細胞體外獲得的主要材料。本研究旨在建立一種簡單、高效分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）的方法，為進一步研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司，中國），明膠（Sigma，USA），M199培養(yǎng)液和胎牛血清（FBS，Gibico，USA），CD34抗體（Miltenyi Biotec，Germany），人纖維連接蛋白（BD Biosciences，USA），F(xiàn)ITC－CD31抗體（晶美生物公司，中國），PE－CD144抗體（eBiosciences，USA），血管性假血友病因子（vWF）抗體（Abcam，England），Dil－標記的乙?；兔芏戎鞍祝―il-AcLDL,Molecular Probes，USA）。EPICS ALTRA流式細胞儀（Beckman，USA）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC的原代分離及培養(yǎng) 收集2009年2月—2009年7月我院健康產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)后的15條臍帶20～30 cm（產(chǎn)婦知情同意），立即放入4℃無菌磷酸鹽緩沖液（PBS）中，分離培養(yǎng)在2 h內(nèi)進行。在無菌條件下剪去破損或有夾痕、血腫部分，用PBS沖洗至靜脈內(nèi)無血，用止血鉗夾住一端，另一端插管注入0.25%的胰蛋白酶，使之充盈后夾閉臍帶，將其放入無菌容器內(nèi)，37℃孵育10～15 min。收集消化液和消化后無菌PBS沖洗液，20℃～25℃1 200 r/min離心10 min,棄上清。用5～10 mL含20%血清的M199培養(yǎng)液重懸細胞，將細胞移入1.5%明膠包被過的培養(yǎng)瓶中，置于37．0℃、5%CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)，24 h后換液，之后隔天換液。

1.2.2 HUVEC傳代培養(yǎng) 原代細胞培養(yǎng)8 d左右，生長達80%～90%融合時進行傳代培養(yǎng)。用PBS沖洗，加入0．25%胰蛋白酶消化，倒置顯微鏡下見細胞變圓、皺縮成團后加入200 mL/L胎牛血清的M199終止消化，用吸管輕輕吹打均勻成細胞懸液，按1∶2接種于培養(yǎng)瓶中。

1.2.3 HUVEC的鑒定 鏡下觀察細胞形態(tài)，取3代細胞進行表型鑒定和實驗。貼壁內(nèi)皮細胞用胰酶消化，1×105細胞重懸于50 μL的EP管，分別加入鼠抗人CD144、CD31、CD45、CD34單克隆抗體，陰性對照管不加一抗，室溫閉光孵育30 min，1%多聚甲醛固定。流式細胞儀分析鑒定細胞。vWF抗體在用Trition-X100破細胞膜后加入，余步驟同上。

1.2.4 HUVEC的功能檢測 取1、5代細胞培養(yǎng)6 d后，避光條件下加入濃度為10 mg/L的Dil－AcLDL，37℃孵育24 h。熒光顯微鏡下觀察細胞攝取Dil－AcLDL的情況。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮細胞形態(tài)學(xué)觀察 消化分離的原代內(nèi)皮細胞為成團的小圓形細胞，2 h開始貼壁生長，24 h細胞完全貼壁。貼壁細胞呈條索形，7～8 d細胞明顯增多呈漩渦樣生長，此后細胞繼續(xù)增多接近融合呈鋪路石樣改變，見圖1。細胞1∶2傳代培養(yǎng)后，約10 d左右可長滿瓶底達到80%～90%融合，繼續(xù)傳代，傳6代后完成實驗。

2.2 內(nèi)皮細胞表型及功能鑒定 流式檢測內(nèi)皮細胞（P3）特異性標志物，高表達CD144（91．52±5．61）%、vWF（85．95±6．14）%、CD31（94．26±3．75）%，部分表達CD34（45．32±4．26）%，CD45表達陰性，見圖2。用Dil－AcLDL與培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞共孵育24 h后，在熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)貼壁細胞中胞漿呈現(xiàn)紅色熒光，而胞核不顯色，證明細胞均攝取Dil－AcLDL（紅色熒光標記蛋白），提示貼壁細胞為有功能活性的內(nèi)皮細胞，見圖3。

3 討論

HUVEC獲取的方法有機械刮取法[3]、組織塊和酶消化法3種。前2種方法因混雜過多的雜細胞如纖維細胞、血細胞而被后者取代。酶消化法獲取血管內(nèi)皮細胞可采用胰蛋白酶、膠原酶或混合酶，膠原酶的作用較溫和,消化過程中不易損傷內(nèi)皮細胞，但價格昂貴、消化時間相對較長;胰蛋白酶消化作用強,對細胞有毒性作用,但其價廉。本實驗采用胰蛋白酶消化法,實驗中筆者將灌注胰酶的臍靜脈兩端封閉后放入37℃溫水中，分別消化25 min、15 min、10 min，發(fā)現(xiàn)消化10 min后獲得的內(nèi)皮細胞生長活性好，其余消化時間獲得的細胞在培養(yǎng)傳代過程中逐漸失去活性而死亡。因此筆者認為只要掌握最佳消化時間、條件，并及時終止消化,就可以成功獲得足夠多的內(nèi)皮細胞，這是保證實驗成功的關(guān)鍵之一。

HUVEC較動物內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)困難,原代培養(yǎng)不易成功。實驗過程中筆者認為需注意以下幾點：（1）取下的臍帶最好在2 h內(nèi)將細胞分離完畢,這樣能提高分離細胞的成活率。（2）內(nèi)皮細胞具有相互接觸促生長作用，因此細胞接種密度不能過低，實驗中發(fā)現(xiàn)當細胞接種密度低于1×105/cm2時內(nèi)皮細胞增殖能力明顯減弱，傳代后細胞不易成活。（3）采用明膠鋪瓶能夠促使內(nèi)皮細胞貼壁生長，且細胞形態(tài)伸展良好。（4）傳代時需把握胰蛋白酶的消化時間,防止酶對細胞的損傷。一般在細胞回縮變圓成團時即可終止消化,然后將細胞吹打下來。（5）實驗中發(fā)現(xiàn),隨著傳代次數(shù)的增加,細胞胞漿逐漸減少,胞核逐漸變大，細胞也變得較為扁平似鋪路石樣改變,尤其是傳3代以上與原代細胞區(qū)別甚為明顯，其原因有待進一步探討。（6）在細胞培養(yǎng)過程中有研究者在培養(yǎng)液中加入生長刺激因子來促進細胞生長、貼壁[4-5]，筆者認為這些促進內(nèi)皮細胞貼壁及生長的刺激因子加入后可能成為影響實驗結(jié)果的混雜因素,限制內(nèi)皮細胞的實驗應(yīng)用范圍。因此實驗中筆者采用無細胞因子含200 mL/L胎牛血清的M199培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞生長和形態(tài)正常，并傳5～6代后仍保持內(nèi)皮細胞功能。

總之，本實驗為體外研究藥物對血管內(nèi)皮細胞的作用機制以及研究心血管疾病的發(fā)生機制特別是在研究動脈粥樣硬化發(fā)生的始動因素和分子機制提供了可靠的細胞模型，同時也為利用內(nèi)皮細胞促進人造血管內(nèi)皮化提供充足的細胞來源，從而提高小直徑人造血管的血液相容性及遠期通暢率。

[1]Yildirim S,Boehmler AM,Kanz L,et al.Expansion of cord blood CD34+hematopoietic progenitor cells in coculture with autologous umbilic vein endothelial cells(HUVEC)is superior to cytokine-supplemented liquid culture[J].Bone Marrow Transplant,2005,36(1):71-79.

[2]Meng X,Li ZM,Zhou YJ,et al.Effect of the antioxidant alphalipoic acid on apoptosis in human umbilical vein endothelial cells induced by high glucose[J].Clin Exp Med,2008,8(1):43-47.

[3]Quattrone S,Chiappini L,Scapagnini G,et al.Relaxin potentiates the expression of inducible nitric oxide synthase by endothelial cells from human umbilical vein in in vitro culture[J].Mol Hum Reprod,2004,10(5):325-329.

[4]Marin V,Kaplanski G,Gres S,et al.Endothelial cell culture:Protocol to obtain and cultivate human umbilical endothelial cells[J].J Immunol Methods,2001,254(1-2):183-190.

[5]張小燕，梁朝，趙林，等.人臍靜脈內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)的改進及其鑒定[J].中華醫(yī)學(xué)研究雜志，2005，5(6):386-389.