劉 玲,鐘 玲,馮利平,張 玲

動脈粥樣硬化 (AS)的實質(zhì)是炎癥,單核細(xì)胞是 AS形成過程中最重要的炎癥細(xì)胞,同時也是動脈粥樣硬化斑塊的重要組成成分[1]。它活化后可通過分泌炎癥因子 [如 IL-6和單核細(xì)胞趨化蛋白 -1(MCP-1)],產(chǎn)生一種促炎環(huán)境,促進 AS的發(fā)生發(fā)展。本研究通過體外試驗,將不同血液凈化方式治療前后尿毒癥患者血清與單核細(xì)胞共同培養(yǎng),觀察血清中毒素對單核細(xì)胞分泌炎癥因子 IL-6和 MCP-1的影響,并探討不同血液凈化方式對其的干預(yù)作用。

1 資料與方法

1.1 病例選擇 尿毒癥患者 60例,均為我院 2008年 5月住院或門診行血液凈化治療的維持性血液透析患者,男 30例,女 30例,年齡 25～88歲,平均 (61±15)歲,透析齡 3～96個月,平均 (23±17)月。根據(jù)不同血液凈化方式,將患者隨機分為 3組:(1)單純血液透析 (HD)組20例,其中男 9例,女 11例,平均年齡 (60±17)歲,采用常規(guī)血液透析治療 4 h,濾過膜采用血仿膜,膜表面積 1.4 m2,血流量 230～280 ml/min,透析液流量 500 ml/min,透析機為德國貝朗 DIALOG單泵機;(2)血液透析聯(lián)合血液濾過 (HDF)組 20例,其中男 10例,女10例,平均年齡 (61±16)歲,采用血液透析濾過治療 4 h,采用高通量聚砜膜,膜表面積 1.2 m2,超濾系數(shù) 42,血流量 230～280 ml/min,前稀釋法,置換液流量3 600 ml/h,置換液由機器配制,透析機為德國貝朗 DIALOG+On line雙泵機;(3)連續(xù)性腎臟替代治療 (CRRT)20例,其中男 11例,女 9例,平均年齡 (61±15)歲,采用連續(xù)性腎臟替代治療 8 h,采用日間連續(xù)性靜脈 -靜脈血液濾過(CVVH)法,下機前 2 h換為日間連續(xù)性靜脈 -靜脈血液濾過透析 (CVVHD)模式,選用高通量聚砜膜,膜表面積

1.2 m2,超濾系數(shù) 42,血流量 230～280 ml/min,前稀釋法,置換液流量 4 000 ml/h,置換液根據(jù)謝志萍等[2]配方手工配制,透析機為德國貝朗 CRRT機。所有患者統(tǒng)一使用一次性透析器,普通肝素或低分子肝素抗凝。入選標(biāo)準(zhǔn):透析齡≥3個月,病情穩(wěn)定,近 1個月無嚴(yán)重急、慢性感染、心力衰竭、活動性肝炎、不穩(wěn)定性心絞痛及手術(shù)史。3組不同血液凈化方式患者年齡、性別分布間有均衡性。同時選取 15例年齡、性別匹配的健康人員作為對照組。

1.2 血清制備 各組尿毒癥患者分別于血液凈化治療前和治療結(jié)束后 10 min留取外周靜脈血 5 ml,健康對照者于清晨空腹留取靜脈血 5 ml,標(biāo)本采集后立即置 37℃溫箱孵育 2 h,然后低溫 (4℃)離心分離血清,EP管分裝后儲存于 -70℃冰箱。所有血清標(biāo)本使用前均用 0.22μm的微孔濾器除菌,并檢測內(nèi)毒素水平。

1.3 人單核細(xì)胞 (PBMC)來源、培養(yǎng)方法及實驗分組

1.3.1 PBMC來源和培養(yǎng)方法 無菌抽取 10例尿毒癥患者空腹靜脈血各 10 ml加到肝素抗凝管中,用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC,Hanks液洗滌 3次后,將所有分離的 PBMC混合,臺盼藍染色計數(shù)活細(xì)胞數(shù) ＞95%,再用含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的 RPMI-1640培養(yǎng)液將 PBMC配成 1×106/ml的細(xì)胞懸液,按每孔 1 ml轉(zhuǎn)種于 24孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)于 37℃、二氧化碳濃度為 5.0%的孵箱中。

1.3.2 實驗分組 分組進行實驗:(1)健康對照組,含 5%健康人血清;(2)尿毒癥患者組,分 HD組、HDF組、CRRT組,含 5%患者血清。

1.4 方法 在含 PBMC的細(xì)胞懸液的 24孔培養(yǎng)板中分別加入不同血清 50μl(每個樣本做 2個復(fù)孔),于 37℃5.0%二氧化碳濃度下培養(yǎng) 24 h,吸取上清液,-20℃凍存待檢。酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測 IL-6、MCP-1、同型半胱氨酸(Hcy)、晚期糖基化終產(chǎn)物 (AGEs)和甲狀旁腺激素 (iPTH)的水平。IL-6、MCP-1、Hcy試劑盒由美國 ADL公司提供,AGEs、iPTH試劑盒由美國 USCN LIFE公司提供,內(nèi)毒素試劑盒由科德角國際生物醫(yī)學(xué)科技 (北京)有限公司提供,按說明書操作。晚期氧化蛋白產(chǎn)物 (AOPP)的測定,按文獻 [3]方法進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用以 (x±s)表示,組間比較采用 One-way ANOVA檢驗。

2 結(jié)果

2.1 4組受檢者血液凈化前后血清的內(nèi)毒素水平 4組受檢者血液凈化前血清內(nèi)毒素水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);HD組患者血液凈化后血清內(nèi)毒素水平升高,與血液凈化前比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);HDF組和 CRRT組患者血液凈化前后血清內(nèi)毒素水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05,見表 1)。

表 1 4組血液凈化前后血清內(nèi)毒素水平比較 (x ±s,EU/ml)Table 1 The levels of serum endotoxin in MHD patients and normal control before and after different modes of blood purification

2.2 健康對照組和尿毒癥患者組血液凈化前血清 Hcy、AOPP、AGEs和 iPTH水平 血液凈化前尿毒癥患者組血清Hcy、AOPP、AGEs和 iPTH的水平明顯高于健康對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01,見表 2)。

2.3 不同血液凈化方式治療對尿毒癥患者血清尿毒癥毒素的清除情況

2.3.1 不同血液凈化治療對 Hcy的清除情況 3種血液凈化方式血液凈化后 Hcy水平均有下降,其中 HDF、CRRT血液凈化前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01),而 HD治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05,見圖 1)。

2.3.2 不同血液凈化治療對 AOPP的清除情況 3種血液凈化方式治療后 AOPP水平均有下降,HDF、CRRT治療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01),而 HD治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05,見圖2)。

2.3.3 不同血液凈化治療對 AGEs的清除情況 3種血液凈化方式治療后 AGEs水平均有下降,HDF、CRRT血液凈化前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01),而 HD治療前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05,見圖3)。

2.3.4 不同血液凈化治療對 iPTH的清除情況 HDF和 CRRT治療后 iPTH水平下降,治療前后比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.01),而 HD治療后 iPTH水平略上升,治療前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05,見圖 4)。

表2 MHD組與健康對照組血液凈化前血清 4種毒素水平比較 (x ±s)Table 2 The levels of serum UToxs before blood purification in MHD patients and normal control

圖 1 不同血液凈化治療前后 Hcy的水平Figur e 1 The level of Hcy before and after differentmodesof blood purification

圖 2 不同血液凈化治療前后 AOPP的水平Figur e 2 The level of AOPP before and after different modes of blood purification

圖 3 不同血液凈化治療前后AGEs的水平Figur e 3 The level of AGEs before and after different modes of blood purification

圖 4 不同血液凈化治療前后 iPTH的水平Figur e 4 The level of iPTH before and after different modes of blood purification

表 3 4組受檢者血液凈化前后單核細(xì)胞分泌 IL-6和 MCP-1水平比較(x ±s, μg/L)Table 3 The level of IL-6 and MCP-1 secreting by PHT-1 cell

2.4 4組受檢者上清液中炎癥因子水平比較 與尿毒癥組血清共同培養(yǎng)的 PBMC分泌的 IL-6水平顯著高于健康對照組(P＜0.01);HD組血液凈化前后 PBMC分泌的 IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);HDF組及 CRRT組血液凈化后PBMC分泌的 IL-6水平明顯低于血液凈化前 (P＜0.05)。與尿毒癥組血清共同培養(yǎng)的 PBMC分泌的 MCP-1水平顯著高于健康對照組 (P＜0.01);HD組血液凈化前后 PBMC分泌的 MCP-1水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P＞0.05);HDF組及CRRT組血液凈化后 PBMC分泌的 MCP-1水平明顯低于血液凈化前,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05,見表 3)。

3 討論

心血管疾病 (CVD)是尿毒癥患者常見的并發(fā)癥和首位死亡原因,AS是其最基本的病理學(xué)特征[4]。近年來,越來越多的研究認(rèn)為 AS的本質(zhì)是炎癥,大量資料顯示 AS斑塊中不僅含有脂質(zhì),而且有大量炎癥細(xì)胞浸潤,其中單核細(xì)胞約占80%[1]。AS形成的早期,在多種因素作用下,單核細(xì)胞接觸并黏附到損傷部位的血管內(nèi)皮,繼而進入動脈壁內(nèi)膜下間隙,激活并分化成巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞產(chǎn)生許多物質(zhì)如脂肪酶、活性氧或自由基,進一步使低密度脂蛋白 (LDL)分子氧化,通過其表達的清道夫受體不斷攝取氧化的低密度脂蛋白 (ox-LDL),最終形成泡沫細(xì)胞,構(gòu)成 AS脂質(zhì)條紋的基礎(chǔ),同時單核細(xì)胞活化后可分泌大量炎癥因子,主要成分為 IL-6和 MCP-1等,促進 AS的快速進展。Tzoulaki等[5]報道,IL-6是 AS進程中的炎癥標(biāo)志物,同時也是 CVD的獨立危險因素。MCP-1可特異性趨化、吸引單核/巨噬細(xì)胞,導(dǎo)致炎癥反應(yīng),在AS的發(fā)病機制中起重要作用[6]。

本研究結(jié)果顯示,與尿毒癥患者組血清共同培養(yǎng)的 PBMC上清液中炎癥因子 (IL-6,MCP-1)的水平顯著高于健康對照組。我們在預(yù)試驗中已對患者血清中 IL-6和 MCP-1水平進行檢測,發(fā)現(xiàn)血清中上述因子濃度遠低于上清液,并且將血清加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中后濃度再被稀釋為 1/20,因此血清本身炎癥因子水平差異對上清液中的 IL-6、MCP-1水平的影響極其微弱。健康人與血液凈化患者血清的主要區(qū)別在于尿毒癥毒素 (UToxs)的含量,提示 PBMC細(xì)胞分泌炎癥因子的差異受 UToxs的影響。本研究臨床部分已證實,維持性血液透析患者血清中 Hcy、AOPP、AGEs及 iPTH等水平明顯升高,由于多種尿毒癥毒素在患者循環(huán)中潴留,可進一步促進炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),可能是導(dǎo)致慢性炎癥的重要原因[3,7-9]。

HD組血液凈化后上清液中 IL-6及 MCP-1水平較透前組稍升高,但沒有顯著差異。這可能與血液凈化過程本身存在誘發(fā)炎癥和氧化應(yīng)激的潛在因素有關(guān),如:透析膜生物不相容性可激活補體和單核系統(tǒng)及凝血和纖溶過程,產(chǎn)生大量前炎癥因子和自由基;透析液中微生物和內(nèi)毒素污染;血透中丟失親水性小分子物質(zhì)、微量元素和酶調(diào)節(jié)復(fù)合物,損傷抗氧化系統(tǒng);充分透析后仍不能清除的中大分子毒素等。常規(guī) HD采用的血仿膜透析器孔徑較小,生物相容性相對較差,超濾系數(shù)低,僅能清除小分子毒素 (分子量 ＜500 Da)和少量中分子毒素 (分子量 500～5 000 Da)。AOPP是一組分子量較大的蛋白氧化產(chǎn)物 (60～600 KDa),而 AGEs(分子量 2 000～6 000 Da)和 iPTH(分子量 9 000 Da)屬于中分子毒素,Hcy雖然分子量小,但體內(nèi)游離形式的 Hcy很少,70%～80%以上與白蛋白結(jié)合。因此可能由于 HD不能有效清除中大分子 UToxs,體內(nèi)蓄積的 UToxs誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌 IL-6和 MCP-1等炎癥因子,進一步加重炎癥狀態(tài),是 AS加速形成的病理機制之一。

本研究發(fā)現(xiàn),HDF組和 CRRT組血液凈化后上清液中 IL-6及 MCP-1水平明顯下降。HDF是在 HD治療基礎(chǔ)上,增加對流過程,并選用生物相容性好、超濾系數(shù)高、孔徑較大的高分子纖維膜,能有效去除中分子和部分大分子毒素。CRRT以對流方式緩慢、大量清除溶質(zhì),尤其在清除大分子毒素和炎癥介質(zhì)占有優(yōu)勢。因此 HDF組和 CRRT組血液凈化后血清中的 UToxs濃度明顯降低,提示低水平 UToxs對單核細(xì)胞的活化作用減弱,從而減少炎性因子的分泌。炎癥反應(yīng)是維持性血液透析患者發(fā)生 CVD并發(fā)癥的重要病理基礎(chǔ),近年來越來越多研究顯示,晚期尿毒癥患者體內(nèi) UToxs潴留可能是導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激狀態(tài)的重要原因[10-11],所以如何有效清除 UToxs對于防治心血管疾病有重要的臨床意義。

綜上所述,我們通過體外試驗進一步證實 HDF或 CRRT治療能減輕炎癥反應(yīng),為 HDF和 CRRT延緩維持性血液透析患者心血管并發(fā)癥提供了可靠的實驗室依據(jù)。

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