劉宇文，殷紅妹，鄒耀華

（浙江省杭州市藥品檢驗(yàn)所中藥室，杭州 310017）

枸骨葉為冬青科Aquifoliaceae冬青屬I(mǎi)lex L.植物枸骨 Ilex cornuta L indl.Ex.Paxt.的干燥葉，《中國(guó)藥典》2005年版一部收載本品具有清熱養(yǎng)陰，平肝，益腎的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枸骨葉具有抗生育，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，抗菌等作用。大量的植物化學(xué)研究揭示了三萜及其苷類是枸骨葉中的主要活性成分。然而對(duì)于該植物的質(zhì)量控制分析卻鮮有報(bào)道,僅1995年郭亞健等報(bào)道了采用薄層掃描法對(duì)不同采收期枸骨葉中熊果酸的含量測(cè)定[2]，但因枸骨葉中還含有齊墩果酸，兩者同屬三萜酸，性質(zhì)與化學(xué)結(jié)構(gòu)較為相似，薄層色譜（TLC）法定量時(shí)，兩者相互干擾，并且熊果酸在紫外區(qū)同屬末端吸收，采用高效液相色譜－紫外（HPLC－UV）法測(cè)定效果也不太理想。本實(shí)驗(yàn)首次采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD），用高效液相色譜法對(duì)枸骨葉中熊果酸進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行了方法學(xué)考察，獲得了滿意的結(jié)果。本研究選擇在枸骨葉中大量存在的三萜類化合物熊果酸為指標(biāo)，從而為評(píng)價(jià)枸骨葉藥材的質(zhì)量提供新的方法和科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑、試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀，AlltechELSD 400型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。甲醇（色譜純，Tedia公司，美國(guó)），水（超純水），醋酸銨（分析純，上海金賽醫(yī)藥化工有限公司生產(chǎn)）。熊果酸對(duì)照品（110742－200516，中國(guó)藥品生物制品檢定所），枸骨葉樣品采自杭州，由本所殷紅妹副主任藥師鑒定。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10.80 mg,置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻。

2.2 樣品溶液的配制 取60℃干燥的枸骨葉粉末（過(guò)3號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，稱定質(zhì)量，回流提取0.5h，再稱定，并用溶劑補(bǔ)足，搖勻過(guò)濾，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：phenomene×C18柱（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇：0.5%醋酸銨溶液（92∶8）；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；ELSD 漂移管溫度∶60℃，霧化氣體為空氣：3.56bar；放大系數(shù)（Gain）：4，在此色譜條件下，熊果酸峰與干擾峰完全達(dá)到基線分離（R＞1.5），理論板數(shù)以熊果酸峰計(jì)在5000 mm以上。對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1，樣品色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1 對(duì)照品溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standard substance

圖2 樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of sample

3 結(jié)果

3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液3、5、10、15、20、30 μL 進(jìn)樣，注入液相色譜儀測(cè)定。以峰面積積分值的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（μg）的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，采用雙自然對(duì)數(shù)法進(jìn)行線性回歸。結(jié)果熊果酸線性回歸方程為Y＝1.4667X＋2.6213（r＝0.9998），線性范圍為 0.648～6.48 μg。

3.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣，6次，熊果酸峰面積平均值為1582.3[相對(duì)平均標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＝ 1.5%]。

3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，精密吸取5 μL，每隔2 h測(cè)定1次，熊果酸峰面積平均值為1597.8（RSD＝2.0%），說(shuō)明供試品溶液在 24 h 之內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品6份，分別按2.2項(xiàng)下方法操作測(cè)定。結(jié)果樣品中，熊果酸平均含量為1.29%（RSD ＝1.6%）。

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取3.4項(xiàng)下已知含量的供試品（1.29%）6份，各精密加入熊果酸對(duì)照品一定量，照供試品溶液的制備法進(jìn)行處理，測(cè)定其中熊果酸的含量。結(jié)果熊果酸的平均加樣回收率為97.1%（RSD＝1.7%）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收實(shí)驗(yàn)Tab.1 The recovery rate of added samples

3.6 樣品含量測(cè)定 取不同批次枸骨葉樣品,用本實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其中熊果酸的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)比較了回流提取與超聲波處理兩種提取方法,結(jié)果熱回流提取0.5 h的含量明顯高于超聲提取0.5 h，而回流提取1 h與0.5 h含量相當(dāng)，所以選擇熱回流提取0.5 h作為供試品處理方法。

表2 不同枸骨葉中熊果酸的含量Tab.2 Determination results of different sample %

ELSD作為一種質(zhì)量型檢測(cè)器，在比較寬的范圍內(nèi)，峰面積（A）與樣品的質(zhì)量（mg）成雙對(duì)數(shù)線性關(guān)系。定量分析時(shí)，為得到精確的數(shù)據(jù)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品做校正曲線對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行校正或直接用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。方法中確定的ELSD參數(shù)，是經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)后得出的最佳儀器參數(shù)，不同的實(shí)驗(yàn)室操作時(shí)需注意做相應(yīng)的調(diào)節(jié)。

實(shí)驗(yàn)中所用枸骨葉采集時(shí)間不相同，熊果酸含量相差不大，而嫩葉含量稍高，與以前文獻(xiàn)報(bào)道枸骨葉中熊果酸的含量測(cè)定結(jié)果基本一致。

本方法快速簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，可為《中國(guó)藥典》中枸骨葉藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供一定的參考。另有文獻(xiàn)記載色譜圖中熊果酸附近的干擾峰為齊墩果酸峰[3]，能否利用同一系統(tǒng)同時(shí)檢測(cè)枸骨葉中兩種物質(zhì)的含量，有待于進(jìn)一步研究。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民國(guó)和國(guó)藥典[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005:174-174.

[2] 郭亞鍵,崔玉萍,周 靜,等.不同采集期枸骨葉中熊果酸含量測(cè)定[J].中國(guó)中藥雜志,1995,20(10):591-593.

[3] 顧學(xué)芳,田 澍,黃 丹.苦丁茶中熊果酸和齊墩果酸的提取及含量測(cè)定[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2008,29(5):96-98.