宋秋荷，王 魯，葛 蘭，邢曉婧，鐘白玉，郝 飛

現(xiàn)階段流行病學(xué)調(diào)查研究表明，早期快速、準(zhǔn)確檢測(cè)白念珠菌對(duì)于念珠菌感染的確診及制定有效的治療方案十分重要。已有研究對(duì)抗白念珠菌芽管胞壁外膜單克隆抗體MAb03.2 C1-C2的早期快速實(shí)驗(yàn)室診斷白念珠菌感染打下了一定的基礎(chǔ)，但對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)室中保存的菌種或不同地域分離的臨床菌株是否能得到同樣的結(jié)論還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，還需要擴(kuò)展并確定該單抗在臨床中檢測(cè)白念珠菌的意義。為此，本文對(duì)該單克隆抗體特異性及臨床的拓展應(yīng)用進(jìn)行較大樣本的研究，以探討其應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的可行性。

1 資料與方法

1.1 菌株來(lái)源及鑒定

白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC-90028、都柏林念珠菌CCCCM IDC8a及類星形念珠菌CCCCM IDC7為第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院皮膚科保存菌株。白念珠菌及其他非白念珠菌的酵母菌為重慶市第一人民醫(yī)院真菌室和九江學(xué)院臨床醫(yī)院皮膚科的臨床分離株。金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌由第三軍醫(yī)大學(xué)臨床微生物教研室贈(zèng)送。臨床分離株通過(guò)血清芽管試驗(yàn)及厚壁孢子試驗(yàn)初步鑒定為白念珠菌及非白念念珠菌。白念珠菌通過(guò)45℃溫度生長(zhǎng)及木糖同化試驗(yàn)后進(jìn)一步鑒定 ，非白念念珠菌通過(guò)API 20C AUX 鑒定板條進(jìn)行鑒定。

1.2 靜止態(tài)ATCC-90028孢子誘導(dǎo)芽管形成 參考方法[1]。

1.3 臨床分離白念珠菌孢子誘導(dǎo)芽管形成 參考方法[1]。

1.4 非白念念珠菌菌絲誘導(dǎo) 參考孫仁美等[2]方法。

1.5 金黃色葡萄球菌和綠膿假單胞菌的培養(yǎng)和鑒定

1.5.1 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)和鑒定 將金黃色葡萄球菌接種入7.5%NaCl肉湯中，37℃增菌培養(yǎng)24h；再將上述稀釋液或培養(yǎng)液分別劃線血平板和Baird-Parker平板，置37℃分離培養(yǎng)24h。從平板上挑取可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色觀察、血漿凝固酶試驗(yàn)、耐熱核酸酶試驗(yàn)。

1.5.2 綠膿假單胞菌培養(yǎng)和鑒定

普通肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h觀察，并繼續(xù)培養(yǎng)至72h可產(chǎn)生菌膜。

1. 6 臨床標(biāo)本采集

1.6.1 分別在重慶和九江兩地收集臨床口腔念珠菌病患者口腔真菌涂片標(biāo)本和陰道念珠菌病患者陰道真菌涂片標(biāo)本中鏡檢菌絲陽(yáng)性標(biāo)本，并將其涂片風(fēng)干，4℃保存?zhèn)溆?。?biāo)本進(jìn)行常規(guī)的真菌培養(yǎng)鑒定。

1.6.2 留取系統(tǒng)性真菌感染患者分泌物或血樣標(biāo)本真菌培養(yǎng)陽(yáng)性者的靜脈血，離心后取血清，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 腹水單抗的制備與純化

采用第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院皮膚科自制的抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原雜交瘤細(xì)胞株[1]，誘導(dǎo)并純化腹水單抗MAb03.2 C1-C2，具體操作參考徐志凱等[1,3]方法。

1.7.1 動(dòng)物種類與來(lái)源 6～8 周雌性BALB/c 小鼠，購(gòu)于重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.7.2 小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)-腹水法，參考方法[1]。

1. 8 間接免疫熒光

1.8.1 抗原包被 用帶不完全1640液誘導(dǎo)的ATCC-90028帶芽管孢子作抗原包被載玻片，陰性及陽(yáng)性對(duì)照。臨床分離的念珠菌孢子和菌絲、常見(jiàn)酵母菌孢子、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、臨床口腔念珠菌感染患者假膜涂片及陰道念珠菌病患者白帶涂片作抗原包被玻片。

1.8.2 間接免疫熒光（IIF）法 腹水單抗為一抗（1︰100稀釋），異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠IgG （工作濃度1︰100）為二抗，行常規(guī)的IIF法。

1.9 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

用確定的臨床凍存的系統(tǒng)性真菌感染患者血清為抗原包被酶標(biāo)板，封閉后與腹水單抗37℃孵育1 h，洗滌后加辣根過(guò)氧化物（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠IgG（工作濃度1︰5000），孵育及洗滌同上，加鄰-苯二胺（orth-phenylene diamine，OPD）底物顯色20min后終止反應(yīng)，以上每步均用PBS加Tween20洗滌液洗滌3次，每次3min，同時(shí)設(shè)陰性和空白對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

臨床分離株共計(jì)135株白念珠菌，61 株8種非白念念珠菌，4株新型隱球菌。

2.2 ATCC-90028靜止態(tài)孢子誘導(dǎo)芽管結(jié)果

得到ATCC-90028帶芽管孢子，芽管誘導(dǎo)率＞95%。

2.3 臨床分離白念珠菌芽管或菌絲誘導(dǎo)結(jié)果

得到臨床分離白念珠菌帶芽管孢子，芽管誘導(dǎo)率＞68%。

2.4 非白念念珠菌、新型隱球菌菌絲誘導(dǎo)

61例8種非白念念珠菌中除光滑念珠菌外均可誘導(dǎo)出菌絲。新型隱球菌未見(jiàn)芽管或菌絲形成（表1）。

表1 臨床分離的非白念念珠菌（61例）及新型隱球菌（4例）菌絲誘導(dǎo)結(jié)果

2.5 腹水單抗的制備

誘生小鼠腹水單抗,并用IIF檢測(cè)到腹水抗體滴度可達(dá)1: 25600。

2.6 間接免疫熒光

2.6.1 135例臨床分離白念珠菌孢子表面熒光均為陰性，芽管或菌絲表面熒光均為陽(yáng)性（圖1）。

圖1 白念珠菌芽管顯示熒光，孢子不顯示熒光

2.6.2 新型隱球菌、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌表面均不存在熒光。

2.6.3 口腔念珠菌病和陰道念珠菌病患者臨床標(biāo)本經(jīng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)鑒定，其中122例口腔念珠菌病患者中84例為白念珠菌（68.85%），38例為非白念念珠菌。78例陰道念珠菌病患者中，51例為白念珠菌（65.38%），27例為非白念念珠菌。135例白念珠菌孢子表面熒光均為陰性，菌絲表面熒光均為陽(yáng)性。而65例臨床分離的非白念念珠菌及新型隱球菌的芽管和孢子上均有熒光（圖2） 。

圖2 非白念念珠菌孢子和芽管均顯示熒光

2.6.4 系統(tǒng)性真菌感染患者血清學(xué)ELISA檢測(cè)結(jié)果

臨床通過(guò)標(biāo)本培養(yǎng)共確診深部真菌感染7例，其中3例為白念珠菌菌血癥，2例肺曲霉病，2例新型隱球菌腦炎。用單抗進(jìn)行血清學(xué)ELISA法檢測(cè)，3例白念珠菌菌血癥中全部陽(yáng)性，2例肺曲霉病和2例新型隱球菌腦炎均為陰性。

3 討論

近20年來(lái)，由于抗生素、免疫抑制劑及皮質(zhì)類固醇激素在臨床上的廣泛應(yīng)用，以及器官移植、導(dǎo)管插管和放療、化療等治療技術(shù)的開(kāi)展，尤其是免疫抑制或免疫缺陷的患者在不斷地增加[4,5]，導(dǎo)致系統(tǒng)性真菌的感染率逐年上升，增加約40倍，且死亡率高[6]。國(guó)內(nèi)統(tǒng)計(jì)中占住院患者病死率的29%（無(wú)真菌感染者僅為17%），國(guó)外占院內(nèi)感染的25%[6]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，器官移植受者和惡性腫瘤病人中系統(tǒng)性真菌感染的發(fā)病率高達(dá)20%～40%，而且往往是致命的感染[7]。

白念珠菌感染率已由1986年的5.0%驟升到1996年的19.6%，從而躍居系統(tǒng)性真菌感染的第一位。白念珠菌及同屬的其他菌種對(duì)系統(tǒng)性抗真菌藥物如唑類藥的敏感性不同，因此快速診斷并將念珠菌鑒定到種對(duì)于確定有效的治療十分重要[4,8]。針對(duì)白念珠菌在致病時(shí)所具備或釋放的某些特異性抗原的檢測(cè)已經(jīng)成功地運(yùn)用到臨床檢測(cè)工作中，如白念珠菌烯醇化酶，白念珠菌胞壁重要成分磷脂酶和天冬氨酸蛋白酶等[9-12]。

白念珠菌是生物有機(jī)體內(nèi)的雙相真菌。理論上，當(dāng)白念珠菌系統(tǒng)性感染時(shí)，同源可溶性抗原釋放入血，白念珠菌形態(tài)可發(fā)生改變，由孢子相轉(zhuǎn)向芽管相，因此在血中檢測(cè)到白念珠菌芽管或菌絲的特異性抗原，可以最后確診為系統(tǒng)性白念珠菌感染[13]。而單克隆抗體因?yàn)槠涓叨鹊奶禺愋钥梢宰鳛檠鍣z測(cè)的主要成分。

在此之前，很多學(xué)者進(jìn)行了抗白念珠菌芽管外膜雜交瘤細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)，用白念珠菌芽管孢子進(jìn)行免疫，獲得MAb C7，結(jié)果IFA顯示該單抗特異性不強(qiáng)，與白念珠菌、葡萄牙念珠菌、新型隱球菌等菌種均可反應(yīng)[14,15]，2000年Marot-Leblond 等[16]又成功制備了世界上第一例抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原雜交瘤細(xì)胞株，在對(duì)其分泌的單抗做了初步分析的同時(shí)，對(duì)單抗的特異性也進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其單抗只與白念珠菌及類星形念珠菌的芽管外膜反應(yīng)。目前，這方面的研究尚無(wú)明顯進(jìn)展，但我們就白念珠菌的生物學(xué)特征和臨床致病特點(diǎn)來(lái)看，研究白念珠菌芽管胞壁外膜抗原的特性和其抗體的應(yīng)用，也許是今后解決快速、早期檢測(cè)深部白念珠菌感染的一條捷徑。所以我們?cè)诔晒χ苽淞藛慰筂Ab03.2C1-C2之后，針對(duì)該單抗的特異性驗(yàn)證，進(jìn)行了多中心多地域的病原體采集和實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)再次應(yīng)用本科制備的雜交瘤細(xì)胞株所對(duì)應(yīng)的抗白念珠菌芽管外膜抗原特異性單抗MAb03.2C1-C2于多地域的臨床分離株和深部白念珠菌感染的檢測(cè)，結(jié)果顯示單抗的特異性很高，達(dá)到100%。在白念珠菌孢子部位及與白念珠菌形態(tài)學(xué)上特別接近都柏林念珠菌的芽管和孢子上均無(wú)熒光可見(jiàn)，并成功地用此單抗與芽管和菌絲之間的交叉反應(yīng)來(lái)鑒定并區(qū)分臨床中白念珠菌和其他念珠菌、酵母菌、細(xì)菌感染。在檢測(cè)深部白念珠菌感染時(shí)所花費(fèi)的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于真菌培養(yǎng)的時(shí)間,為今后研究該單抗快速、早期地診斷及鑒別深部白念珠菌感染打下了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此，在結(jié)合并總結(jié)前人[2]工作的基礎(chǔ)上，我們初步判斷該株單抗MAb03.2C1-C2是目前惟一一株抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原特異性的單克隆抗體，為該單抗今后在實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用中起到進(jìn)一步先證作用。

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