曹珊珊,李瑞芳,方偉進(jìn),李 艷,王建剛,杜景霞,黃國輝

目前,國內(nèi)外常利用犬、大鼠、兔等動(dòng)物制作高血壓模型,其中腎動(dòng)脈狹窄性高血壓模型由于簡(jiǎn)便可靠被廣泛應(yīng)用于人類高血壓及并發(fā)癥的研究。腎血管性高血壓(reno vascular hypertension, RVH)是指單側(cè)或雙側(cè)腎動(dòng)脈的主干或其分支狹窄,使腎血流量減少,導(dǎo)致腎缺血引起的高血壓,為繼發(fā)性高血壓最為常見的病因。 RVH模型是高血壓發(fā)病機(jī)制研究和藥物評(píng)價(jià)的常用動(dòng)物模型,我們通過摸索,對(duì)現(xiàn)有的雙腎雙夾(two kidneys two clips, 2K 2C)高血壓模型制作方法進(jìn)行了改良,獲得了理想的成模率,同時(shí)減少了實(shí)驗(yàn)并發(fā)癥的發(fā)生。

1 材料和方法

1.1 藥品及儀器戊巴比妥納(中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司);鈦合金制“U”型夾(鄭州),規(guī)格:內(nèi)徑0.3 mm;手術(shù)絲線, 規(guī)格(5/0);青霉素G(華北制藥),規(guī)格80萬U/瓶;紅霉素軟膏;75%酒精;生理鹽水;BP-6無創(chuàng)動(dòng)物血壓測(cè)試儀(四川);BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)測(cè)試儀(上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組成年健康雄性SD大鼠94只(體質(zhì)量100±10 g,由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),隨機(jī)分為假手術(shù)組(20 只)和模型組(74只)。大鼠分籠飼養(yǎng)于室溫18 ～25℃,日照12 h,相對(duì)濕度45%～55%,通風(fēng)良好的環(huán)境中,飼喂普通飼料,自由飲水。

1.3RVH的模型制作腹腔注射1 %戊巴比妥納溶液(35 mg/kg),麻醉SD大鼠, 15 ～20 min后大鼠即被麻醉。俯臥位固定備皮消毒后,于第3腰椎棘突水平沿背部后正中線切開皮膚3 ～4 cm,用棉簽鈍性分離雙側(cè)皮下淺筋膜,狹窄左腎動(dòng)脈時(shí),于約第十二胸椎水平距棘突旁約1.5 cm處用直剪剪開肌腱、腹膜進(jìn)入腹腔,用棉簽沾生理鹽水后入腹腔探測(cè)腎臟位置,根據(jù)腎門的具體位置沿棘突方向擴(kuò)大手術(shù)開口直至腎臟及腎門清晰地暴露于視野下。左腎動(dòng)靜脈包裹在一個(gè)血管鞘中,通常情況下左腎動(dòng)脈位于深靜脈的上后方(偶爾會(huì)出現(xiàn)在腎靜脈下方或橫跨在腎靜脈的上方),可用濕潤生理鹽水的棉簽撥開腎靜脈,再用無齒小彎鑷在動(dòng)靜脈之間小心分離,分離出左腎動(dòng)脈約0.5 cm,將一內(nèi)徑為0.3 mm的鈦合金夾呈水平方向套在左腎動(dòng)脈上,務(wù)必使左腎動(dòng)脈全部落入鈦合金夾頂部的圓形小孔內(nèi),再用小直鑷夾閉兩腳,以狹窄后左腎顏色變?yōu)椤皽\紅色”為宜。向腹腔內(nèi)注入青霉素G 4萬U,關(guān)閉腹腔開口。狹窄右腎動(dòng)脈時(shí),手術(shù)開口較左腎開口處高約1 cm,暴露右腎及右腎蒂,右腎動(dòng)脈位置變異少,且與右腎靜脈相距稍遠(yuǎn),較左腎動(dòng)脈易于分離。在下腔靜脈和腹主動(dòng)脈之間與右腎水平線相交處分開腹膜后壁,即見右腎動(dòng)脈,分離狹窄右腎動(dòng)脈,具體方法同左腎動(dòng)脈。多數(shù)情況下肉眼可見右腎動(dòng)脈直徑較左腎動(dòng)脈大,故鈦合金夾直徑的選擇上亦可以視具體情況進(jìn)行調(diào)整,本研究常用0.3 ～0.35 mm內(nèi)徑鈦合金夾狹窄右腎動(dòng)脈,亦以狹窄后右腎顏色變?yōu)椤皽\紅色”為宜。后注入青霉素G 4萬U,關(guān)閉右側(cè)腹腔。雙腎動(dòng)脈狹窄都完畢后,行腹腔、肌層全層連續(xù)縫合,再注入青霉素G 4萬U后,間斷縫合皮膚,用碘伏再次消毒皮膚縫合口,去除血跡,對(duì)皮,涂上紅霉素軟膏,手術(shù)完成。假手術(shù)組僅游離左、右腎動(dòng)脈,不予狹窄,其余過程同手術(shù)組。待動(dòng)物蘇醒后,放入單籠飼養(yǎng),注意保持呼吸道通暢,用100 W白熾燈距離60 cm照8 h以保溫,術(shù)后禁食24 h,但不禁水,術(shù)后3 d密切觀察皮膚切口,精神狀態(tài)及進(jìn)食進(jìn)水情況。于術(shù)后3 d開始每天注射青霉素G 8萬U,共5 d。

1.4 血壓測(cè)量無創(chuàng)血壓測(cè)量:采用BP-6無創(chuàng)動(dòng)物血壓測(cè)試儀測(cè)定大鼠清醒狀態(tài)下尾動(dòng)脈血壓。將大鼠置于儀器配套的固定籠中,置30℃恒溫箱預(yù)熱15 min,待大鼠完全安靜后將鼠尾套袖放置于鼠尾的根部,套袖以約20 ～30 mmHg/s的速度自動(dòng)充氣加壓直至脈搏波消失,維持6 s后套袖自動(dòng)放氣,出現(xiàn)的第1個(gè)血壓波即為收縮壓。連續(xù)測(cè)量至少3 次,每次測(cè)量間隔一定時(shí)間, 記錄心率(HR≤10 次/min)、血壓(BP≤6 mmHg)的3次讀數(shù),取其均數(shù)為當(dāng)天收縮壓值,以此法測(cè)量大鼠術(shù)前血壓,每周測(cè)壓1次,進(jìn)行血壓的動(dòng)態(tài)觀察。有創(chuàng)血壓測(cè)量:各組動(dòng)物在觀察期滿后用1%的戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔麻醉,導(dǎo)管內(nèi)充滿肝素,右頸總動(dòng)脈逆行插管至左心室,另一端接BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司),導(dǎo)管口在右頸動(dòng)脈內(nèi)時(shí),連續(xù)記錄血壓5 min。取平穩(wěn)的一段血壓曲線記錄主動(dòng)脈收縮壓和舒張壓(AOSP, AODP)進(jìn)入左心室后測(cè)左室收縮末壓和左室舒張末壓(LVESP, LVEDP),室內(nèi)壓最大上升和下降速率(±dP/dtmax)和心率(HR)。

1.5 高血壓模型成功的標(biāo)準(zhǔn)血壓在 85 ～120 mmHg范圍為正常血壓大鼠,以2K2C手術(shù)4周后動(dòng)物血壓明顯升高超過自身術(shù)前血壓30 mmHg以上,且解剖后雙腎無壞死,萎縮或纖維化為模型復(fù)制成功;術(shù)后血壓無明顯升高或死亡者為失敗。

1.6 左心室質(zhì)量指數(shù)的測(cè)定試驗(yàn)結(jié)束時(shí),大鼠插管測(cè)壓后,開胸取出心臟,置于預(yù)冷的生理鹽水中,濾紙吸干后稱心臟重量(HW)。沿房室環(huán)剪去左、右心房及右心室游離壁,用電子天平稱取左心室(包括室間隔)重量(LVW),并與體重(BW)相除,計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,結(jié)果以±s表示,組間比較采用t檢驗(yàn), P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型成活率本實(shí)驗(yàn)共使用94只大鼠進(jìn)行造模,假手術(shù)組(n=20), 2K2C組(n=74);研究觀測(cè)直至6周末,經(jīng)檢測(cè), 82只大鼠成活,模型成活率為87%。 2只麻醉過淺術(shù)中掙扎出血死亡, 4只麻醉過深術(shù)后未蘇醒,麻醉死亡占6.4%;2只術(shù)后1 h內(nèi)死亡,多考慮是急性腎功能衰竭,占2.1%;4只于術(shù)后1周內(nèi)感染死亡,占4.3%。術(shù)后6 周有4只血壓上升小于30 mmHg,模型成功率為83%。見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)大鼠成活、成模情況

2.2 血壓升高情況術(shù)前我們用無創(chuàng)血壓儀對(duì)大鼠進(jìn)行測(cè)壓,選取血壓小于120 mmHg的大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,術(shù)后6周,經(jīng)頸總動(dòng)脈插管有創(chuàng)測(cè)壓,假手術(shù)組的血壓和術(shù)前相比無顯著差異,實(shí)驗(yàn)組血壓明顯上升, 6周末維持在165 mmHg左右,并趨于穩(wěn)定,血壓和心功能見表2。

表2 術(shù)后6周大鼠血壓及心功能變化情況

2.3 右心室質(zhì)量指數(shù)從表3可以看出,實(shí)驗(yàn)組-6周與對(duì)照組-6周組相比,體重?zé)o顯著差異(P>0.05),左心室重(LVW)、左心室重/體重(LVW/BW)顯著增加(P<0.01)。

表3 體重和左心室質(zhì)量指數(shù)

3 討論

腎動(dòng)脈狹窄性高血壓模型是應(yīng)用廣泛的高血壓動(dòng)物模型,復(fù)制方法主要有幾種, 1K1C(一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄,另一側(cè)腎切除), 2K1C(一側(cè)腎動(dòng)脈狹窄,另一側(cè)腎保留),和2K2C(雙腎動(dòng)脈均狹窄)。狹窄腎動(dòng)脈的方法眾多,或用套管、或用U型銀夾、或用有機(jī)玻璃夾、或用絲線結(jié)扎、或用自制鋁夾等方法[1]。套管法在體型較大的動(dòng)物如狗等效果明顯,但小型動(dòng)物不易開展;U型銀夾套入血管后需用眼科鑷夾閉兩腳,致使腎動(dòng)脈狹窄程度不易控制,易造成急性腎功能衰竭;有機(jī)玻璃夾亦需特殊的工具研制;而絲線結(jié)扎的效果不太穩(wěn)定。采用背部開口,因?yàn)槟I臟是腹膜后器官,與腹部開口相比,在手術(shù)過程中不需將腸管、腹腔臟器翻出腹腔,避免損傷肝臟、乳糜池、腹腔內(nèi)血管,同時(shí)可以避免由于腸管復(fù)位錯(cuò)亂造成術(shù)后腸扭轉(zhuǎn)或腸梗阻。術(shù)后傷口愈合較腹部開口快,采用的鈦合金夾在體內(nèi)不會(huì)被氧化,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可回收反復(fù)利用,節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本。

關(guān)于2K2C法成功復(fù)制RVH模型,應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①麻醉:麻醉深度對(duì)于模型的制作亦很重要。麻醉過深,術(shù)后蘇醒較慢,甚至死亡。本研究中4 例大鼠死于麻醉過度;麻醉過淺動(dòng)物掙扎則易出現(xiàn)出血、腹臟器損傷、拖延手術(shù)時(shí)間,試驗(yàn)中2例大鼠因麻醉較淺,出現(xiàn)上述情況致腎靜脈大出血。雖然麻醉劑有一定的合適劑量范圍,由于不同批次大鼠體質(zhì)不同,產(chǎn)生麻醉的效果也不同。因此在每次大規(guī)模實(shí)驗(yàn)前均必須摸索適宜的麻醉劑的劑量。 ②鈍性分離,減少出血,筋膜剝離需干凈。雖然模型制作簡(jiǎn)單,術(shù)后的出血和感染仍是手術(shù)最為常見的并發(fā)癥。初學(xué)模型制作時(shí),術(shù)后出血是大鼠死亡最常見的原因。由于腎動(dòng)、靜脈緊貼伴行,因此,鈍性分離動(dòng)靜脈之間的筋膜時(shí),需撥開靜脈,避免損傷靜脈,減少和避免術(shù)后出血是模型成功制作的關(guān)鍵[2]。本研究中有2例大鼠死于腎功能衰竭,分離腎動(dòng)脈時(shí),必須注意筋膜是否分離干凈,上夾后夾子能否沿動(dòng)脈滑動(dòng),已證實(shí)腎素—血管張素系統(tǒng)是腎血管性高血壓大鼠腎功能衰竭的重要原因[3]。 ③避免牽拉,縮短手術(shù)時(shí)間。雙腎上夾應(yīng)在5 min內(nèi)完成。另外,熟練的操作可避免由于腎血管的反復(fù)牽拉致腎臟長(zhǎng)期缺血或淤血,操作時(shí)間過長(zhǎng)易引起的感染,在我們的研究中發(fā)現(xiàn)這些因素均與術(shù)后死亡有關(guān)。④避免手術(shù)感染。研究發(fā)現(xiàn),相當(dāng)部分的大鼠死亡發(fā)生于術(shù)后1個(gè)月,術(shù)后感染是常見原因,所以嚴(yán)格、細(xì)致的管理也是模型成功的重要方面。保持飼養(yǎng)房空氣流通和適宜的溫度最為重要,一般飼養(yǎng)區(qū)內(nèi)溫度必須保持在19 ～29 ℃[4,5]。我們?cè)谛g(shù)前用硫化鈉對(duì)大鼠背部進(jìn)行褪毛備皮,避免術(shù)中鼠毛掉至腹腔中,術(shù)中每側(cè)夾子安放完畢都腹腔給予少量青霉素G,術(shù)后再連續(xù)5 d腹腔注射青霉素G,都是為了避免因感染造成的死亡。我們動(dòng)態(tài)觀察了實(shí)驗(yàn)組術(shù)后血壓的變化,結(jié)果術(shù)后2周血壓即明顯升高,超過自身基礎(chǔ)血壓30 mmHg以上, 6周時(shí)已經(jīng)能夠形成穩(wěn)定高血壓,血壓值維持在165 mmHg范圍,模型復(fù)制成功率為83%,與文獻(xiàn)報(bào)道相近,說明我們的模型制作方法可行。

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