杜 帥 張艷軍 佟永領(lǐng) 劉麗華 劉俊靜 天津中醫(yī)藥大學中藥學院 (天津 300193)

舒腦欣滴丸由傳統(tǒng)方劑“芎歸湯”發(fā)展而來,成分為川芎和當歸,具有理氣活血,化瘀止痛的功效 ,臨床上用于血虛血瘀引起的頭痛、頭暈、視物昏花、健忘、失眠及偏頭痛等癥狀,療效明顯,但其治療偏頭痛的作用機制尚不明確,有待進一步研究。

1 實驗材料 1.1 實驗動物 健康雄性 SD大鼠,體重270±20 g,北京維通利華實驗動物有限公司(合格證號 SCXK(京 )2008-0001)。

1.2 藥物與試劑 硝酸甘油注射液(國藥準字號:H11020289),西比靈(國藥準字號:H10930003),正天丸 (國藥準字號:Z44020711),舒腦欣滴丸,TRNzol總 RNA提取試劑盒、 RNase Free Water(RT121-01)、EB(RT203)(天根生化科技北京有限公司),PCR Kit(AMV)Ver.3.0(DRR019A)、瓊脂糖 (D601)、6×Loading Buffer、 200dp Maker(D514A)、 DN A Ladder Maker(D514A)(寶生物工程大連有限公司),PCR反應引物β-actin、c-fos(上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司 )。

1.3 儀 器 光學顯微鏡(Olympus),Du530核酸蛋白分析儀(Beckman),PE-480基因擴增儀(Hybaid),ECP3000型凝膠電泳儀、YY-155-94型電泳槽(北京六一廠),Gene Genius凝膠成像分析儀(Bio Image system Gene Company)。

2 實驗方法 2.1 分組及給藥 各實驗動物隨機分為正常組 ,模型組,舒腦組高、低劑量組,西比靈組,正天丸組。復制模型前每組灌胃給藥 4d,給藥劑量:舒腦欣高劑量組 90.72mg? kg-1,舒腦欣低劑量組 45.36mg? kg-1,西比靈 1mg?kg-1,正天丸 1.62g? kg-1。正常組和模型組分別給予等量生理鹽水。第 5d造模后 30min給藥 1次。

2.2 偏頭痛大鼠模型制備 采用 Cristina方法,皮下注射硝酸甘油注射 10mg? kg-1,復制實驗性大鼠偏頭痛模型。大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅,前肢頻繁搔頭,爬籠次數(shù)增多,煩躁不安等癥狀。

2.3 大鼠腦膜組織形態(tài)學觀察 行為學評價后,用 10%水合氯醛(0.3mL? kg-1)腹腔注射麻醉,經(jīng)左心室灌注固定,斷頭取部分系著腦膜的顱骨放入 4%多聚甲醛(4℃)中備用。腦膜HE染色,將腦膜從置于 4%多聚甲醛的顱骨上分離后,做常規(guī)石蠟切片。全部標本的 HE染色切片均由兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師在雙盲情況下進行觀察復核。

2.4 腦干內(nèi)痛覺相關(guān)基因 c-fos檢測 各組大鼠斷頭取腦,迅速分離腦干 ,將腦干放入 ep管內(nèi),標記后置于液氮內(nèi)保存?zhèn)溆?。RT-PCR方法檢測樣本目的基因 mRNA的表達,引物序列如下。目的基因:β-actin,引物序列:上游:AGAGGGAA ATCGTGC下游:CGAT AGTGATGACCT。目的基因:c-fos,引物序列:上游:ACGCGGACTACGAGGCGTCAT下游:CTTCGGAT TCTCCGT TTCTC。

3 結(jié) 果 3.1 大鼠行為觀察 大鼠置于安靜的實驗場所適應環(huán)境,1h后開始復制偏頭痛模型。除空白對照組外,其余動物造模后均出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、爬籠次數(shù)增多,煩躁不安等現(xiàn)象。治療組動物在給藥后,上述現(xiàn)象逐漸消失,趨于正常。模型組動物上述現(xiàn)象持續(xù)約 3h,繼而出現(xiàn)蜷臥,活動減少狀態(tài)。

3.2 大鼠腦膜組織形態(tài)學觀察 鏡下觀察毛細血管、組織結(jié)構(gòu)變化,炎性細胞滲出(圖 1-6)。正常組:可見正常的毛細血管,腦膜組織結(jié)構(gòu)完整緊密,但發(fā)現(xiàn)部分擴張毛細血管周圍存在淋巴細胞。模型組:可見毛細血管擴張,細胞間結(jié)構(gòu)疏松,組織水腫,大量炎性細胞(以中性粒細胞為主)存在于血管內(nèi)。舒腦欣高劑量組:血管擴張不明顯,細胞間結(jié)構(gòu)較疏松,輕度水腫。舒腦欣低劑量組:可見毛細血管擴張,血管周圍組織輕度水腫,部分血管周圍有炎性細胞(以中性粒細胞為主)滲出。正天丸組:可見毛細血管擴張,血管周圍細胞間結(jié)構(gòu)疏松,組織水腫,有炎性細胞(中性粒細胞和淋巴細胞 )滲出。西比靈組:可見毛細血管擴張明顯,血管周圍組織水腫,部分血管周圍存在巨噬細胞。

表1 各組大鼠腦干 c-fos mRNA表達 (±s)

表1 各組大鼠腦干 c-fos mRNA表達 (±s)

注:與模型組比較,△P＜0.05;與西比靈比較 ,▲P＜0.05;與正天丸組比較,◇P＜0.05。

分 組 n c-fos正常組 (1) 6 0.27± 0.12△模型組(2) 6 1.19±0.51舒腦欣高劑量組(3) 6 0.63±0.06△▲舒腦欣低劑量組(4) 6 0.30±0.03△◇西比靈組(5) 6 1.05±0.13正天丸組(6) 6 0.77± 0.33△

3.3 舒腦欣滴丸對偏頭痛模型大鼠腦干中 c-fos基因表達的影響(圖 7-8)

實驗結(jié)果顯示,硝酸甘油誘導偏頭痛模型大鼠腦干 c-fos基因表達較正常組明顯上調(diào),與模型組和西比靈組比較,舒腦欣高、低劑量組均能下調(diào)異常升高的 c-fos基因表達;且舒腦欣低劑量組效果更加顯著。

4 討 論 偏頭痛的疼痛主要源于三叉神經(jīng)支配的硬腦膜、蛛網(wǎng)膜和軟腦膜。腦膜血管具有與其它血管相同的解剖和生理特點,刺激腦膜血管可產(chǎn)生搏動性頭痛。多數(shù)學者認為偏頭痛的發(fā)病機制是外周傷害性刺激激活中樞和外周的三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)引發(fā)頭痛發(fā)作[1,2]。研究證明,硝酸甘油模型是通過導致腦膜血管擴張、神經(jīng)源性炎癥形成及激活下丘腦、腦干及脊髓節(jié)段神經(jīng)元功能等作用引起三叉神經(jīng)纖維超敏既誘發(fā)頭痛[3]。

本實驗通過硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦膜切片 HE染色發(fā)現(xiàn),模型組與正常組比較有明顯的毛細血管擴張,細胞間結(jié)構(gòu)疏松,組織水腫,大量炎性細胞(以中性粒細胞為主)存在于或滲出血管等現(xiàn)象,表明皮下注射硝酸甘油引起的無菌性炎癥確實存在。其他給藥組較模型組在上述癥狀上表現(xiàn)較輕,尤其是舒腦欣高、低劑量組,能明顯緩解硝酸甘油引起的神經(jīng)性炎癥。

原癌基因 c-fos屬于即刻早期基因,對神經(jīng)遞質(zhì)、激素、神經(jīng)沖動及外界剌激引起的傳入信息,在數(shù)分鐘中就會作出反應進行表達。c-fos基因在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的表達與痛覺調(diào)控密切相關(guān)[4]。 Hunt[5]發(fā)現(xiàn),外周的傷害性疼痛剌激可以快速透導中樞神經(jīng)系統(tǒng) c-fos的表達。也有學者研究發(fā)現(xiàn)[6,7],一些治療偏頭痛的藥物對偏頭痛發(fā)作期異常升高的 c-fos有抑制作用。由此可見,c-fos基因異常表達與偏頭痛必定存在內(nèi)在聯(lián)系。因此,本實驗考察舒腦欣滴丸對偏頭痛模型大鼠腦腦干中 c-fos mRN A表達的影響,結(jié)果顯示,硝酸甘油誘導偏頭痛模型大鼠腦干 c-fos mRNA表達較正常組明顯上調(diào),且具有顯著性差異,舒腦欣高、低劑量組均能下調(diào)異常升高的 c-fos mRNA表達,舒腦欣低劑量組效果更為明顯。

綜上所述,舒腦欣滴丸對偏頭痛模型大鼠的治療作用可能是通過改善硝酸甘油引起的腦膜神經(jīng)性炎癥、抑制腦干異常上調(diào)的 c-fos基因表達,從而緩解偏頭痛的癥狀而實現(xiàn)的。

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