李彥華 孫學(xué)芬 李惠武 關(guān)宏恩 汪常偉 鄒廣華 亞生江 徐紅霞

新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第四臨床醫(yī)院耳鼻喉科(烏魯木齊 830000)

世界范圍內(nèi)約有 2.78億人患有中度以上的聽力損失。2006年中國第二次殘疾人抽樣調(diào)查顯示:全國殘疾人總數(shù)高達(dá)8000多萬,多重殘疾中有聽力殘疾的 776萬,言語殘疾 127萬[1]。耳鳴耳聾嚴(yán)重影響到患者的身心健康,常常導(dǎo)致失眠、疲勞、精神緊張、注意力不集中、情緒消沉,最終影響人的生活質(zhì)量,包括社交和工作[2]。耳鳴耳聾在維吾爾族發(fā)病率比較高,根據(jù)導(dǎo)師多年臨床經(jīng)驗總結(jié)耳鳴耳聾疾病是新疆地區(qū)的高發(fā)病,而且新疆地區(qū)維吾爾族耳鳴耳聾患者中 50%～60%屬于腎虛血瘀型,本課題組主要探討維吾爾族耳聾患者腎虛血瘀型與mtDNA12srRNA基因突變的關(guān)系,為基因診斷和治療提供依據(jù),為耳聾疾病的分型、辯證論治提供理論依據(jù),補(bǔ)充分型指導(dǎo)臨床診治。

1 材料與方法 1.1 研究對象 病例來自于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬第四臨床醫(yī)院耳鼻喉科病房住院患者及新疆各地州患者,其中符合耳聾診斷標(biāo)準(zhǔn)患者為抽樣調(diào)查的病例,正常對照組為維吾爾族健康人,不伴有其他疾病。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn):中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3,4]以聽力下降為主要癥狀,或伴耳鳴及輕度眩暈;常有惱怒、勞累、外感等誘因,或使用了耳毒性藥物,或年老體衰、營養(yǎng)不良等因素致病;?？茩z查時鼓膜無穿孔 ,或無混濁、內(nèi)陷、增厚、粘連、鈣質(zhì)沉著等表現(xiàn);純音聽閾測定呈感音神經(jīng)性聾;應(yīng)與耳脹、耳閉、耳眩暈、聽神經(jīng)瘤相鑒別。腎虛血瘀證型辨證標(biāo)準(zhǔn)[5]A耳聾,可伴有耳鳴;B耳鳴如蟬或伴腰膝酸軟,小便清長,頭暈?zāi)垦?虛煩失眠,男子遺精,女子白淫,發(fā)脫齒搖,舌淡胖大或有齒痕,尺脈沉細(xì)或細(xì)弱;C口唇、爪甲色暗,舌質(zhì)暗紅或有瘀斑瘀點,脈澀。符合 A+B+C者可辨為腎虛血瘀型。

西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):感音神經(jīng)性耳聾的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6,7],多因胚胎發(fā)育、遺傳因素、孕期因素、娩出損傷及各種后天原因,引起內(nèi)耳毛細(xì)胞、聽神經(jīng)、聽通路、聽皮層病變。包括先天性感音神經(jīng)性聾(遺傳性聾、非遺傳性聾)和后天延遲出現(xiàn)的感音神經(jīng)性聾,后天非遺傳因素包括:感染、耳毒性藥物、全身系統(tǒng)疾病引起的耳聾、突聾、中樞性聾等。發(fā)病無特殊年齡限制,耳科檢查多為正常耳膜及外耳道;聽力障礙可為單側(cè)或雙側(cè)耳聾聽力檢查,純音聽閾為感音神經(jīng)性聽力障礙,多表現(xiàn)為高頻區(qū)聽力下降。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn):有與國外種族聯(lián)姻家族史者;外耳、中耳畸形;可能導(dǎo)致傳導(dǎo)性耳聾病史,如有急慢性中耳炎的病史;有中耳或外耳手術(shù)史;聲導(dǎo)抗測試結(jié)果異常;伴有某些全身性疾病者(如:心臟病、糖尿病等);影響聽力檢測結(jié)果的疾病(如:智力障礙者);診斷為進(jìn)行性耳聾的患者(如:自身免疫性內(nèi)耳病、梅毒性內(nèi)耳疾病等 );診斷為耳脹、耳閉、耳眩暈、聽神經(jīng)瘤的患者。

1.1.3 耳聾分度標(biāo)準(zhǔn):耳聾分度采用國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)、世界衛(wèi)生組織(W HO)推出類似的耳聾等級標(biāo)準(zhǔn)[6]:輕度聾 26～40dB,中度聾 41～55dB,中重度聾 56～70dB,重度聾 71～90dB,極度聾＞ 91dB。聽閾為純音測聽 500、1000、2000、4000Hz的氣導(dǎo)聽閥平均值。

1.2 病史資料采集 調(diào)查采用調(diào)查問卷形式,發(fā)放“耳聾疾病調(diào)查表”,由患者填寫有關(guān)信息,同時填寫知情同意書。調(diào)查表內(nèi)容由基本信息、耳聾史、家族史、出生史、個人史(發(fā)病前傳染病、耳毒性藥物應(yīng)用情況、頭部是否受外傷等)、體檢(全身及?？撇轶w)等組成。然后按照納入、排除標(biāo)準(zhǔn)由兩名副高以上中醫(yī)師 /中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師進(jìn)行診斷分型。對全部研究對象由專業(yè)檢測人員進(jìn)行純音聽閾、聲導(dǎo)抗多頻率測聽檢查。所有符合標(biāo)準(zhǔn)的耳聾患者均抽取外周靜脈血 4ml,用以提取基因組DN A,分光光度計進(jìn)行純度和濃度鑒定。

2 PCR擴(kuò)增及測序 2.1 mtDNA12srRNA突變檢測測序用引物序列:引物序列 F:5’TGTT TAGACGGGCTCACA TCAC3’;R:5’TT TCATCTT TCCCTTGCGGTAC3’;在mtDNA的位置 648-1601,片段長度 1188bp。

引物由上海生工生物工程有限公司合成,進(jìn)行常規(guī) PCR,反應(yīng)條件為 95℃變性 30秒,57℃復(fù)性 1min,72℃延伸 7min,共35個循環(huán),反應(yīng)終止后再 72℃延伸 5min,并用 1.2%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶效果,見圖一。電泳圖條帶符合標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行基因全長測序。

2.2 PCR產(chǎn)物進(jìn)行直接測序 測序引物與 PCR擴(kuò)增引物相同,正反雙向測序;應(yīng)用 DN Aman軟件分析和判讀結(jié)果,發(fā)現(xiàn)可疑的突變位點后,用 Chromas軟件讀取測序結(jié)果的峰圖文件,進(jìn)行確認(rèn)或排除。

3 統(tǒng)計學(xué)方法 耳聾組突變?yōu)?7例(7/137),正常組突變?yōu)?0例(0/93),耳聾組的突變均出現(xiàn)在腎虛血瘀型組,即腎虛血瘀型突變?yōu)?7例(7/105),非腎虛血瘀型突變?yōu)?0例 (0/32),全部數(shù)據(jù)均采用 SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,對耳聾組和正常組基因突變的差異性進(jìn)行 i2檢驗,得 i2=4.621,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,即兩組比較有差異。耳聾組腎虛血瘀型與 mtDNA12srRNA基因突變有無相關(guān)性進(jìn)行i2檢驗,得i2=10.13,P＜0.05,表明兩者有統(tǒng)計學(xué)意義,即維吾爾族散發(fā)感音神經(jīng)性耳聾腎虛血瘀型與 mtDNA12srRNA基因突變有相關(guān)關(guān)系。

4 結(jié) 果 在 137例耳聾患者中檢測到 A1555G位點有4人有突變,突變熱點 961delT1例,A827G 1例,nt955ccccnt960 1例,正常組均未見上述突變。測序序列圖見下圖二至圖五,箭頭示堿基突變位點及突變峰。

5 討 論 mtDNA12srRNA基因突變在多種族的家系以及散發(fā)病人中均發(fā)現(xiàn)該基因突變發(fā)生率高,mtDNA A1555G位點突變是與耳聾有關(guān)的最常見線粒體突變,一般報道陽性率為 1%～3%[8]。線粒體 DNA的多態(tài)位點還顯示獨(dú)特的多態(tài)性[9],研究表明,不同 mtDN A單體型可以調(diào)節(jié)某些疾病的嚴(yán)重性和外顯率的表達(dá),如耳聾[10]、衰老[11]和視力損失[12]。本實驗中腎虛血瘀型耳聾患者中 mtDN A12srRNA有多種形式的突變,突變熱點 A1555G發(fā)現(xiàn) 4例 ,發(fā)生率為 3.81%(4/105),高于全國平均水平 ,還發(fā)現(xiàn)線粒體突變熱點 961delT 1例,A827G 1例,nt955ccccnt960 1例,新疆 A1555G突變確有較高的陽性率,實驗證明維吾爾族耳鳴耳聾患者腎虛血瘀型與mtDNA12srRNA基因突變有相關(guān)關(guān)系,李琦對烏魯木齊特教學(xué)校研究顯示 A1555G位點漢族陽性率 11.27%,這是迄今為止報道的最高陽性率,mtDN A C1494T突變在新疆耳聾人群中發(fā)生頻率并不高[13],且維吾爾族未發(fā)現(xiàn)該位點突變,和本研究結(jié)果一致,證明了該突變在中國耳聾人群中較為罕見。

中醫(yī)學(xué)早已提出腎和耳有著密切的關(guān)系,《素問?陰陽應(yīng)象大論篇》說:“北方生寒,在臟為腎,在竅為耳”。張大寧多年來對腎的研究,在國內(nèi)率先提出了“腎虛血瘀論”的概念[14]。張鐵英[15]在臨床研究中采用中西藥合用 ,增加內(nèi)耳血流量,改善內(nèi)耳微循環(huán),可使耳聾、耳鳴、眩暈等癥狀得到改善或消失。徐紅霞[16]研究發(fā)現(xiàn)腎虛血瘀型可能是導(dǎo)致新疆地區(qū) GJB2基因突變產(chǎn)生差異性的原因之一,具有一定的民族和地域特點。

在本課題組的多年的臨床研究中發(fā)現(xiàn)耳聾疾病中腎虛血瘀型占有較高的比例,祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎為先天之本”,先天腎精不足可導(dǎo)致先天性感音神經(jīng)性聾,后天病后失養(yǎng),恣情縱欲,多產(chǎn)多育 ,均可耗傷腎精,致子女先天不足 ,導(dǎo)致后天遲發(fā)性感音神經(jīng)性聾,或年老可導(dǎo)致腎精虧虛 ,不能濡養(yǎng)耳竅,致老年性聾,日久累及多個臟腑虧虛,均可引起耳聾;同時維吾爾族以肉食為主 ,飲食習(xí)慣偏重于膏粱厚味,冬季漫長,室外體育活動受到限制,加之喜嗜煙酒,極易形成血瘀體質(zhì),造成耳竅經(jīng)脈壅阻,清竅閉塞,發(fā)生耳鳴耳聾,腎虛與血瘀是相關(guān)并存的,腎虛必兼血瘀,血瘀日久加重腎虛[14]。

綜上所述,新疆維吾爾族腎虛血瘀型與 mtDN A 12srRN A基因突變有相關(guān)性,該基因突變具有種族特異性,現(xiàn)在醫(yī)學(xué)有學(xué)者認(rèn)為線粒體單倍體型的不同可能引起線粒體基因突變攜帶率的不同,進(jìn)而導(dǎo)致不同國家、民族發(fā)病率的差異[13],本課題組分析可能與新疆地處歐亞大陸中心,屬典型的大陸性干旱氣候,獨(dú)特的地理位置、生態(tài)環(huán)境、多民族聚集、飲食多肥甘酒炙之品,形成了具有西域特征的疾病,如穢濁痰阻證、西北燥證等,本病為新疆常見病、多發(fā)病,具有與內(nèi)地不同的疾病證型,同時新疆地處中國西北邊陲,特殊地區(qū)、氣候、環(huán)境、遺傳、飲食等干預(yù)因素相對較多,維吾爾族多族內(nèi)通婚,優(yōu)生優(yōu)育工作開展相對困難,尤其在基層醫(yī)療水平低,導(dǎo)致耳聾的發(fā)病率高。本課題組的研究旨在減少新疆地區(qū)維吾爾族人耳鳴耳聾疾病的發(fā)生 ,貫徹祖國醫(yī)學(xué)“未病先防,治未病”的理念,并補(bǔ)充完善新疆地區(qū)中醫(yī)的辨證分型,及新疆地區(qū)耳鳴耳聾疾病的診斷預(yù)防,為耳鳴耳聾的分型論治提供理論依據(jù),進(jìn)以指導(dǎo)臨床,優(yōu)生優(yōu)育減少發(fā)病率。我們也將近一步深入基因的研究為新疆地區(qū)耳聾防治工作做出更大的努力。

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