戚桂娜 ，張波 ，王彥杰 ，荊瑞勇 ，高亞梅 ，王偉東

（1.黑龍江八一農墾大學生命科技學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學工程學院）

隨著畜禽養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，規(guī)?；笄蒿曫B(yǎng)的比例不斷擴大，大量的沒有處理的畜禽糞尿對環(huán)境造成了嚴重污染，為此，國內外學者就畜禽養(yǎng)殖對環(huán)境污染的影響進行了廣泛深入的研究[1-6]。采用厭氧消化技術處理畜禽糞便等廢棄物，不僅可以減少畜禽糞便對環(huán)境造成的污染，同時還產生清潔的生物質能源沼氣，為固體廢棄物的可再生利用提供了廣泛的應用前景。

厭氧發(fā)酵生產沼氣的過程是由多種微生物相互作用共同來完成的，產甲烷菌群和非產甲烷菌群間通過互營聯合生成甲烷[7，8]，因此，沼氣發(fā)酵微生物的研究一直是該領域研究的熱點。對于沼氣發(fā)酵微生物的研究國內外學者都進行了廣泛的研究，孫征等、Simankova等、Ma等以及Kendall等從不同的環(huán)境中分別分離得到了若干不同的產甲烷古菌[9-12]。人們逐漸意識到發(fā)酵菌種在沼氣發(fā)酵過程中扮演的重要角色，因此，越來越多的研究者對于厭氧發(fā)酵菌種馴化開展了深入的研究，希望通過馴化培養(yǎng)獲得高產氣效率的沼氣發(fā)酵微生物系統(tǒng)。張翔等研究了在高溫條件以生活污水處理廠的不同種類污泥作為接種物對厭氧發(fā)酵各參數的影響，結果表明以馴化后的污泥為接種物，可以加快厭氧啟動速度，提高產氣量[13]。陸清忠等利用馴化的低溫菌群為接種物，加入沼氣池內增加池內微生物菌群的數量來提高產期率，結果比對照日平均產氣量和總產氣量增長率達158.97%和159.03%[14]。眾多研究結果表明，在畜禽糞便厭氧發(fā)酵初始階段加入一定量的接種物，對提早產氣和提高產氣量有重要的作用[15-17]。但是，以往的關于沼氣發(fā)酵接種物的研究，都是直接把沼液或者通過一定的馴化方式馴化的沼液作為接種物作為研究對象，接種物的微生物組成不清楚，接種物不能穩(wěn)定遺傳，無法作為恒定的研究對象進行機理性研究。如果能夠得到遺傳穩(wěn)定、高效產甲烷的復合菌系，既可以解決上述理論研究問題，又可以用于沼氣的生產實踐。本文就是按照上述思路，在實驗室條件下利用限制性培養(yǎng)技術，構建了1組35℃條件下遺傳穩(wěn)定的、產甲烷量高的沼氣發(fā)酵復合菌系并對其培養(yǎng)條件進行了研究，以期獲得該復合菌系最適宜的發(fā)酵條件，達到產氣速度快、產氣量高的目的，為厭氧發(fā)酵的生產實踐提供理論和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗裝置

本試驗所用的沼氣發(fā)酵復合菌系裝置和集氣裝置由兩部分組成，如圖1所示。反應器置于35℃培養(yǎng)箱內恒溫控制，選用250 mL培養(yǎng)瓶作為發(fā)酵裝置，瓶口用適當大小的不透氣橡皮塞塞緊，在橡皮塞的中央用點滴管導氣連接到一個量筒中，將集氣量筒倒扣于盛滿水的容器內，采用排水集氣法收集氣體。

圖1 沼氣復合菌系培養(yǎng)裝置Fig.1 The cultural device of microbial community of biogas production

1.2 試驗材料

沼氣發(fā)酵復合菌系，由本實驗室利用限制性培養(yǎng)技術經過多代的培養(yǎng)獲得，牛糞，厭氧菌培養(yǎng)基，真空泵，集氣量筒等。

1.3 試驗方法

1.3.1 沼氣發(fā)酵復合菌系的構建

將取自黑龍江省大慶市林甸縣沼氣池中的池液作為供菌種樣品，以10%的接種量接種到裝有100 mL無氧富集培養(yǎng)基的沼氣發(fā)酵裝置中，密封，用真空泵抽真空后將純度為99.999%氮氣充入培養(yǎng)瓶中，反復抽真空和充入氮氣，直至加入指示劑樹脂刃天青的發(fā)酵培養(yǎng)基變?yōu)闊o色為止，連接集氣裝置，35℃靜置培養(yǎng)。當日產氣量呈下降趨勢后，取10 mL培養(yǎng)液作為種子接到同樣的新鮮培養(yǎng)基中。如此一直繼代培養(yǎng)，淘汰產氣時間晚、總產氣量低的培養(yǎng)物，留下產氣時間早、總產氣量高的培養(yǎng)物。經幾十代以上連續(xù)繼代培養(yǎng)，選擇高效穩(wěn)定的培養(yǎng)物，進行保存。

1.3.2 發(fā)酵液初始pH對沼氣復合菌系產氣能力的影響

試驗設計 5個pH值因素分別為：6.0、6.5、7.0、7.5和8.0，總固體濃度（TS%）為8%，接種量為10%進行試驗，用甲烷產率作為衡量標準。

1.3.3 接種量對沼氣復合菌系產氣能力的影響

試驗設計3個接種量因素分別為：5%、10%和15%，TS%為8%，pH7.0進行試驗，用甲烷產率作為衡量標準。

1.3.4 底物濃度(TS%)對沼氣復合菌系產氣量能力的影響

試驗設計4個發(fā)酵液濃度因素分別為：6%、8%、10%和12%，接種量為10%，pH7.0進行試驗，用甲烷產率作為衡量標準。

1.3.5 培養(yǎng)條件優(yōu)化組合試驗

分別以初始pH、底物濃度（TS%）和接種量為因素進行了單因素試驗，根據單因素試驗結果，采用正交組合進行試驗，研究各因素組合對沼氣發(fā)酵的影響，用甲烷產率作為衡量標準，因素水平表如表1。因為試驗是3因素3水平的試驗，選取L9（33）即可滿足要求，根據正交表L9（33）安排試驗。

表1 因素水平表Table 1 Different level values of the factors

1.4 測定方法

1.4.1 日產氣量測定

采用排水集氣法。

1.4.2 甲烷含量的測定

測定儀器為島津GC-17A型氣相色譜儀，火焰光度檢測器（FID），毛細柱（DB-1）0.53 mm×15 m。柱溫：100℃；進樣口溫度：110℃；檢測器溫度：200℃；載氣流速：20 mL·min-1；氫氣壓力：50 kpa；空氣壓力：55 kpa。

2 結果與分析

2.1 沼氣發(fā)酵復合菌系的獲得

按照1.3.1的試驗方法，以甲烷產量和產氣時間作為衡量指標，連續(xù)富集培養(yǎng)。逐漸淘汰產氣率低、產氣慢的組合，留下產氣量高、產氣快的組合。經過20代以上的繼代培養(yǎng)，復合菌系的產甲烷能力與產甲烷時間逐漸穩(wěn)定。選取其中一組產氣時間早、產氣量穩(wěn)定的沼氣復合菌系進行連續(xù)5代的富集培養(yǎng)，進行日產氣率分析。圖2為傳代至第22代至26代沼氣復合菌系后發(fā)酵液的日產氣率的變化，從圖中可見，日產氣率逐漸穩(wěn)定，最高產氣率可達1.6 m3·m-3·d-1。

圖2 連續(xù)富集培養(yǎng)五代的沼氣復合菌系的日產氣率的變化Fig.2 Change of daily biogas yield at five different generation of microbial community

2.2 初始pH值對復合菌系產氣能力的影響

不同初始pH值對沼氣復合菌系沼氣發(fā)酵的甲烷產率的動態(tài)變化見圖3。沼氣發(fā)酵進行到第3 d各處理出現甲烷產率高峰，甲烷產量最高的處理為初始 pH 值為 7.0 的處理，為 0.57 m3·m-3·d-1，其次為初始pH值為6.5的處理。隨著培養(yǎng)時間推移，甲烷產率逐漸降低，培養(yǎng)9 d后，各處理甲烷產率趨于平穩(wěn)。由此表明，初始pH值為6.5～7.5是沼氣復合菌系適宜的培養(yǎng)條件。

圖3 初始pH值對接種沼氣復合菌系甲烷產率的影響Fig.3 The effect of different initial pH of microbial community of biogas production on methane yield

2.3 接種量對復合菌系產氣能力的影響

不同接種量接種對沼氣復合系甲烷產率動態(tài)變化的影響見圖4。沼氣發(fā)酵第9 d，各處理出現甲烷產率高峰，最高處理為15%接種量處理，為0.49 m3·m-3·d-1，其次為接種量為5%的處理。但接種量為10%的處理，甲烷產氣高峰出現在第5 d，其甲烷產率為0.45 m3·m-3·d-1。隨著培養(yǎng)時間推移，甲烷產率逐漸降低，培養(yǎng)13 d后，各處理甲烷產率趨于平穩(wěn)。由此表明，與其他處理相比，接種量為10%的處理產甲烷高峰可提前4 d?？紤]成本及產氣高峰出現時間，本研究采用10%為最適接種量。

圖4 接種量對沼氣復合菌系甲烷產率的影響Fig.4 The effect of inoculation quantities of microbial community of biogas production on methane yield

2.4 底物濃度（TS%）對復合菌系產氣能力的影響

不同底物濃度對沼氣復合菌系甲烷產率的動態(tài)變化影響如圖5。沼氣發(fā)酵第7 d，各處理出現甲烷產率高峰，最高處理為底物濃度為8%的處理，甲烷產率為 0.56 m3·m-3·d-1，其次為底物濃度為 10%的處理。隨著培養(yǎng)時間推移，甲烷產率逐漸降低，培養(yǎng)20 d后，各處理甲烷產率趨于平穩(wěn)。由此表明，固形物含量為8%的處理在產甲烷高峰時，可提高甲烷產率。

圖5 底物濃度對沼氣復合菌系甲烷產率的影響Fig.5 The effect of substrate concentrations of microbial community of biogas production on methane yield

2.5 正交組合試驗結果分析

以初始pH、底物濃度（TS%）和接種量為試驗因素，產氣量和產甲烷產量為測定指標設計的正交試驗安排及結果見表2。在9組試驗中產氣量最高的為第 9 組，產氣量可達到 0.52 m3·m-3·d-1，甲烷含量達到 0.40 m3·m-3·d-1。其次是第 3 組試驗，最高產氣量為 0.48 m3·m-3·d-1，甲烷含量為 0.34 m3·m-3·d-1。通過SPSS軟件對試驗結果進行了方差分析結果見表3。

表2 正交試驗方案及試驗結果表Table 2 Orthogonal test analysis and results of the experiments

表3 方差分析結果Table 3 The results of variance analysis

由表3的方差分析結果可知，試驗各因素均未達到顯著水平，可能是由于所選因素不夠全面，在此梯度范圍內差異不夠明顯。但是，從產氣量和甲烷含量分析可知：B因素（底物濃度）F值最大，其次是因素A（接種量），影響最小的為C因素（pH）。說明，在整個發(fā)酵過程中發(fā)酵液底物的總固體濃度在發(fā)酵過程中對產氣量的影響最大，接種量對發(fā)酵的影響不大，接入接種物一般是為了加大發(fā)酵體系的微生物量，加快發(fā)酵啟動的時間和縮短發(fā)酵周期的目的。C因素在整個發(fā)酵過程中的影響不顯著且作用最小，說明整個發(fā)酵系統(tǒng)對pH的緩沖能力比較強，在較寬泛的范圍內都能進行正常的沼氣發(fā)酵。

所以，通過本實驗可以得出在后續(xù)的發(fā)酵過程中為了盡量提高底物濃度，一般選取5%為接種量，10%的底物濃度，pH一般自然狀態(tài)就可以。這樣不但可以增加產量，同時也可以提高甲烷的含量。

3 討論與結論

隨著對禽畜糞便厭氧發(fā)酵中微生物菌群功能的逐漸認識，人們逐漸意識到了純培養(yǎng)的局限性，一些研究者已經開始利用各種方法研究利用多次馴化培養(yǎng)的培養(yǎng)物為接種物來進行沼氣發(fā)酵的實驗[18-20]，但是在人工可控條件下具有遺傳穩(wěn)定和產氣能力穩(wěn)定的產甲烷復合菌系還未見報道。本實驗構建的中溫35℃條件下產氣和遺傳穩(wěn)定的沼氣發(fā)酵復合菌系，產氣率與其他研究報道相比相對低[21-23]，分析其原因可能如下：首先，整個發(fā)酵過程沒有進行攪拌，同時是分批試驗，不是連續(xù)進出料試驗，造成產氣率較低。其次，發(fā)酵原料為牛糞，牛糞本身的產氣率較低。第三，發(fā)酵容器體積小，可能影響產氣率。針對以上分析，今后試驗將進行相應的改進。

本試驗以牛糞為發(fā)酵基質，在設計的三個單因素試驗中，pH6.0～8.0中以初始pH值為7.0的處理與其他組相比效果最好，這和Herbert、劉德江等的試驗pH值在6～8范圍內均可發(fā)酵、但是pH調到7.5左右發(fā)酵最佳的報道相符[24，25]。接種量的試驗中接種量為10%的處理產甲烷高峰可提前4 d，與15%接種量相比提前達到產甲烷的高峰期，綜合考慮成本及產氣高峰出現時間等因素，10%可作為適宜的接種量。在底物濃度的實驗中，底物濃度為8%時甲烷含量最高。在夏季氣溫較高條件下，當底物濃度達到10%、12%時，發(fā)酵液濃度過高造成了發(fā)酵液的pH變化過大，進而影響了微生物的生長，所以產甲烷量就受到了明顯的影響，這與夏國俊的研究，沼氣池在夏季最佳物料濃度為6%～10%相符[26]。這說明采用不同的發(fā)酵工藝形式，發(fā)酵料液的濃度對產氣效果的影響是不同的。通過單因素和L9（33）正交實驗分析，根據實際情況進行修正后確定該沼氣復合菌系的最佳發(fā)酵條件為：接種量5%，底物濃度10%，pH自然狀態(tài)，培養(yǎng)溫度35℃。

［1］Flamant J C，Beranger C，Gibon A.Animal production and land use sustainability an approach from the farm diversity at territory level ［J］.Livestock Production Science，1999，61：275-286.

［2］Gerber P，Chilonda P，Franceschini G，et al.Geographical determinants and environmental implications of livestock production intensification in Asia ［J］. Bioresource Technology，2005，96：263-276.

［3］Gerber P J，Carsjens G J，Pak-uthai T，et al.Decision support for spatially targeted livestock policies：Diverse examples from Uganda and Thailand ［J］.Agricultural Systems，2008，96：37-51.

［4］李帷，李艷霞，張豐松，等.東北三省畜禽養(yǎng)殖時空分布特征及糞便養(yǎng)分環(huán)境影響研究［J］.農業(yè)環(huán)境科學學報，2007，26(6)：2350-2357.

［5］王方浩，馬文奇，竇爭霞，等.中國畜禽糞便產生量估算及環(huán)境效應［J］.中國環(huán)境學，2006，26(5)：614-617.

［6］王輝，董元華，張緒美.集約化養(yǎng)殖畜禽糞便農用對土壤次生鹽漬化的影響評估［J］.環(huán)境科學，2009，29(1)：183-188.

［7］Stams A J M.Metabolic interactions between anaerobic bacteria in methanogenic environments［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，1994，66：271-294.

［8］Xiu zhu Dong，Stams A J M.Evidence for H2and formate formation during syntrophic degradation of butyrate and propionate［J］.Anaerobe，1995，1：35-39.

［9］孫征，周宇光，東秀珠.一個甲烷桿菌新種的描述和系統(tǒng)分類學研究［J］.微生物學報，2001，3(41)：265-269.

［10］Simankova MV，Kotsyurbenk OR，Lueders T，et al.Isolation and characterization of new strains of methanogens from cold terrestrial habitats［J］.System atic and Applied Microbiology，2003，26：312-318.

［11］Ma K，Liu X，Dong X.Methanobacterium beijingense sp.nov，a novel methanogen isolated from anaerobic digesters［J］.InternationalJournalofSystematic and Evolutionary Microbiology，2005，55：325-329.

［12］Kendall M M，Liu，Sie Prawska-Lupa M Stetter KO，et al. Methanoeoceuaeolicus sp. nov， a mesoPhilic，methanogenic arehaeon from shallow and deep marine sedimens，Int［J］.Syst Evol Microblol，2006，56(7)：1525-1529.

［13］張翔，劉金盾.接種物特性對牛糞高溫厭氧發(fā)酵的影響［J］.農機化研究，2007，6：86-89.

［14］陸清忠，鄧功成，趙洪.農村沼氣池接種低溫馴化沼氣發(fā)酵微生物試驗［J］.現代農業(yè)科技，2009，5：268-271.

［15］潘云霞.牛糞厭氧發(fā)酵特性的研究［C］.哈爾濱：東北農業(yè)大學，2004.

［16］T.Forster-Carneiro，Pe ’rez.M.Dry-thermophilic anaerobic digestion of organic fraction of the municipal solid waste：Focusing on the inoculum sources［J］.Bioresource Technology，2007，98：3195-3203.

［17］Akila G，Chandra T S.Performance of an UASB reactor treating synthetic wastewater at low-temperature using cold-adapted seed slurry ［J］.Process Biochemistry，2007，42：466-471.

［18］潘云鋒，李文哲.物料濃度對畜糞厭氧消化的影響［J］.農機化研究，2008，1：193-199.

［19］潘云霞，潘云鋒，李文哲.不同階段沼液作發(fā)酵接種物對牛糞產氣的影響［J］.農機化研究，2005，1：202-204.

［20］馬傳杰，花日茂，郭亮.接種量對牛糞厭氧干發(fā)酵的影響家畜生態(tài)學報［J］.2008，29(5)：81-84.

［21］Khursheed K，Rebecca H.Anaerobic digestion of animal waste：Waste strength versus impact of mixing ［J］.Bioresource Technology，2005，96：1771-1781.

［22］Mohammad A S，Nidal M.Start-up of an UASB-septic tank for community treatment of strong domestic sewage［J］.Bioresource Technology，2008，99：7758-7766.

［23］Sigrid K，Hans O，Thomas J.Biogas production with horse dung in solid-phase digestion systems［J］.Bioresource Technology，2008，99：1280-1292.

［24］Herbert H，P.Liu H F.Effect of pH hydrogen production from glucose by a mixedculture［J］.Bioresource Technology，2002，82：87-93.

［25］劉德江，高桂麗，朱妍梅，等.豬糞、牛糞、羊糞沼氣發(fā)酵比較試驗［J］.塔里木大學學報，2005，17(2)：10-12.

［26］夏國俊.農村能源開發(fā)建設與標準規(guī)范實用手冊［K］.北京：北大方正電子出版社，2002.