孫留霞，侯喜林，余麗蕓

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

新城疫（Newcasltle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的禽類一種以呼吸道、消化道黏膜出血為典型病變的急性、高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病。該病發(fā)病急、致死率高，已成為養(yǎng)禽業(yè)危害最大、經(jīng)濟損失最嚴重的疾病之一[1]。NDV屬于副粘病毒科（Paramyxoviridae）、副粘病毒亞科（Paramyxovirinae）、禽腮腺病毒屬（Avulavirus）的單股負鏈RNA病毒。NDV整個基因組全長約15 kb，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白NP、磷酸化蛋白P、RNA依賴的RNA聚合酶L、融合蛋白F、血凝素-神經(jīng)氨酸酶HN、基質(zhì)蛋白M[2]。HN和F為糖基化蛋白，是NDV感染細胞所必需的，為主要的免疫保護性蛋白。HN蛋白識別并吸附于細胞表面的受體，參與病毒粒子感染。F蛋白能促進病毒囊膜與宿主細胞膜融合、相鄰宿主細胞之間發(fā)生融合，是構(gòu)成致病力的重要成分[3]。因此F和HN蛋白的研究對防制新城疫具有重要意義。

本研究欲對NDV-Lasota株HN基因進行克隆和原核表達，通過Western blotting對表達產(chǎn)物的免疫原性進行研究，以期為利用HN基因研制雞新城疫基因工程疫苗或診斷試劑提供理論依據(jù)和基礎(chǔ)素材，并為進一步研制預(yù)防雞新城疫基因工程疫苗奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒、菌株和質(zhì)粒 NDV-Lasota疫苗株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；表達載體pET-30a(+)、宿主菌DH5α、BL21(DE3)由本實驗室保存。

1.2 試劑 pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶、dNTP、RNA酶抑制劑、M-MLV、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ等購自Fermentas公司；Trizol Reagent購自Invitrogen公司；IPTG、膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒均為大連寶生物工程有限公產(chǎn)品；DAB購自AMRESCO公司；雞源NDV標準血清購于中監(jiān)所；HRP標記的羊抗雞IgG均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的NDV-Lasota株 HN基因全序列，利用DNAStar和Prime 5.0設(shè)計一對對引物，在上游引物中引入BamHⅠ限制性內(nèi)切酶位點，在下游引物中引入HindⅢ限制性內(nèi)切酶位點（酶切位點用下劃線標記），預(yù)計擴增片斷為1590 bp。引物由上海生物工程有限公司合成。序列如下：

1.4 病毒的增殖 將NDV Lasota疫苗用PBS稀釋后尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，置37℃孵育。24 h內(nèi)死亡的棄掉，每天照蛋兩次。無菌收集24～72 h雞胚的尿囊液，3000 r/min離心30 min去除雜質(zhì)，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 病毒RNA的提取 按照Trizol Reagent說明書提取病毒總RNA。

1.6 目的基因的擴增、克隆與測序

1.6.1 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 取5 μL提取的RNA樣品，加入3 μL下游引物，3 μL無Rnase水，70℃預(yù)熱 5 min，冰浴 5 min，依次加入 4 μL 5×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、3 μL 10 mmol·L-1dNTPs、1 μL Rnasin（40 U/μL）、1 μL M-MLV，總體積 20 μL，42 ℃溫浴 1 h。

1.6.2 PCR 擴增體系（25 μL） 10×PCR Buffer緩沖液 2.5 μL，dNTP 2 μL，上下游引物各 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.5 μL，模板 2 μL，加水至 25 μL。循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)，最后72℃ 延伸10 min。

1.6.3 HN基因克隆與測序 將PCR產(chǎn)物純化回收，并與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，用LB瓊脂平板（含Amp+）篩選，提取質(zhì)粒，酶切鑒定重組質(zhì)粒，陽性克隆命名為pMD-HN，送上海生工測序。

1.7 重組原核表達載體的構(gòu)建 用BamHⅠ和HindⅢ從pMD-HN質(zhì)粒上雙酶切下目的基因片斷，純化回收后與同樣雙酶切的pET-30a（+）載體相連，轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細胞，用LB瓊脂平板（含Kan+）篩選，挑取單個菌落于37℃過夜振蕩培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒命名為pET-HN。

1.8 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達及SDS-PAGE分析 將獲得的陽性重組菌株BL21(pET-NDV/HN)按1%接種LB液體培養(yǎng)基（含Kan+）中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.5～0.7時，加入IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，誘導(dǎo)表達目的蛋白，并分別在 3、4 和 5 h時取1.0 ml菌液，同時收集未誘導(dǎo)的菌液作為陰性對照，對經(jīng)轉(zhuǎn)化BL21的空載體也以相同的條件誘導(dǎo)，作為對照。于12%的SDS-PAGE檢測重組蛋白。

1.9 重組蛋白的Western blot鑒定 對誘導(dǎo)5 h的重組菌進行Western blot檢測鑒定。蛋白樣經(jīng)SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的PBST封閉，以雞源NDV陽性血清為一抗，羊抗雞IgG-HRP為二抗，DAB顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 HN基因的擴增和克隆 RT-PCR擴增出約1590 bp左右大小的片斷，與預(yù)測結(jié)果一致（圖1）?；厥諗U增產(chǎn)物，克隆到pMD18-T載體中，得到重組質(zhì)粒pMD-N，經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定正確（圖2）。

圖1 HN基因RT-PCR擴增產(chǎn)物M.DNA標準；1.HN基因RT-PCR產(chǎn)物；2.陰性對照Fig.1 The amplified HN gene by RT-PCR M.DNA Marker；1.The RT-PCR product of HN;2.Negative control

圖2 重組質(zhì)粒pMD-HN酶切鑒定M.DNA標準；1.pMD-HN的酶切產(chǎn)物Fig.2 Identification of recombinant N plasmid by Restriction enzyme M.DNA Marker；1.pMD-HN digested by BamHⅠand HindⅢ

2.2 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定 用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定重組表達質(zhì)粒pET-HN，酶切結(jié)果與預(yù)期大小相符（圖3）。

圖3 重組表達質(zhì)粒的酶切鑒定M.DNA分子質(zhì)量標準;1-4.pET-HN的雙酶切產(chǎn)物Fig.3 Identification of recombinant plasmid by restriction digestion

2.3 SDS-PAGE檢測結(jié)果 IPTG誘導(dǎo)表達重組菌，表達產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE電泳、染色、脫色后，發(fā)現(xiàn)含重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)菌在64.3kDa處出現(xiàn)一條較粗的蛋白帶，大小與融合蛋白的理論值一致，隨著誘導(dǎo)時間的增加，其表達量隨之增加，在5 h時達到最大值，而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌均沒有出現(xiàn)相同的條帶（圖4）。

圖4 IPTG誘導(dǎo)表達HN蛋白的SDS-PAGE分析1.誘導(dǎo)產(chǎn)物 3 h；2.誘導(dǎo)產(chǎn)物 4 h；3.誘導(dǎo)產(chǎn)物 5 h；4.重組菌誘導(dǎo)前；5,6.pET-30a誘導(dǎo)前后陰性對照；M.蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準Fig.4 SDS-PAGE of induced expression of HN protein by IPTG

2.4 重組蛋白的免疫活性鑒定 表達蛋白經(jīng)PVDF膜轉(zhuǎn)印后，與雞源抗NDV陽性血清作用，再經(jīng)羊抗雞IgG/HRP二抗作用，DAB染色后，在預(yù)期位置出現(xiàn)明顯的條帶，與預(yù)計大小一致，而未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌均未見此特異性融合蛋白條帶（如圖5），說明表達的蛋白可被雞源抗NDV陽性血清識別。

圖5 重組蛋白的Western blot鑒定M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1.pET-30a；2.重組菌誘導(dǎo)前；3.重組HN蛋白Fig.5 Western blot analysis of the expressed product

3 討論

HN蛋白是NDV的主要保護性抗原，在疾病感染過程中發(fā)揮重要作用，同樣也是新城疫基因工程疫苗研制的首選蛋白。HN是NDV囊膜上較大纖突的糖蛋白，具有血凝素和神經(jīng)氨酸酶兩種活性[4]。HN借助其血凝素成分使病毒吸附到含唾液酸受體的易感細胞，這是病毒感染的第一步。而神經(jīng)氨酸酶有分解病毒與細胞結(jié)合的能力，在病毒生命周期中起增加病毒粒子遷移性的作用。近年來發(fā)現(xiàn)，HN有促進膜融合的作用，即協(xié)助F蛋白的融合作用。它以N末端插入到病毒囊膜內(nèi)，即親水的氨基酸位于胞內(nèi)，而長的疏水氨基酸跨過囊膜，形成近膜區(qū)。當NDV接觸宿主細胞時，HN蛋白首先以C末端識別宿主細胞膜上的受體位點并與之結(jié)合，同時其自身構(gòu)象也發(fā)生改變。當HN空間構(gòu)象發(fā)生改變后，影響到相鄰F蛋白的空間構(gòu)象，使F蛋白N末端融合多肽釋放，發(fā)揮穿膜作用，介導(dǎo)病毒囊膜與宿主細胞表面脂蛋白膜融合，病毒核衣殼釋放到胞漿內(nèi)，引起細胞病變[5，6]。

pET-30a（+）是一種十分有效的表達外源基因的原核表達載體，含T7啟動子、起始密碼子和轉(zhuǎn)錄終止信號。本試驗設(shè)計引物時借助載體上的起始密碼子AUG，所以pET-30-HN表達的HN蛋白分子量為64.3 kDa，而不是HN蛋白的預(yù)期大小58.3 kDa。

目前國內(nèi)外學(xué)者對NDV的結(jié)構(gòu)蛋白研究頗多，HN已在多種體系中表達。前人研究發(fā)現(xiàn)，去除HN蛋白N端的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)后的片段，這樣可排除N端信號肽區(qū)和跨膜區(qū)在表達過程中的干擾，從而使去除HN蛋白N端的跨膜區(qū)和胞質(zhì)區(qū)后的目的蛋白得以高水平的表達[7]。因此，本研究設(shè)計引物時，去除了N端的胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)后的片段，成功表達了NDV-Lasota株的HN蛋白，為新城疫的防制和診斷方法的研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

［1］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］Cho S H，Kim S J，Kwon H J.et al.Genomic sequence of an antigenic variant Newcastle disease virus isolated in Korea［J］.Virus Genes，2007，35(2)：293-302.

［3］王忠田，王澤霖，陳博言，等.新城疫分子生物學(xué)最新研究進展［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2002，23（2）：33-36.

［4］塞弗.禽病學(xué)［M］.11版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005.

［5］Estevez C，King D，Seal B，et al.Evaluation of Newcastle disease virus chimeras expressing the Hemagglutinin-Neuraminidase protein of velogenic strains in the context of a mesogenic recombinant virus backbone［J］.Virus Res，2007，129(2)：182-190.

［6］王紅寧.禽呼吸系統(tǒng)疾?。跰］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［7］冉旭華，聞曉波，趙喜紅，等.新城疫病毒F和HN蛋白的原核表達［J］.生物技術(shù)，2008，18（3）：13.