尤克強(qiáng)，張小寶，傅誠(chéng)章

（1.江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院麻醉科 222000；2.江蘇省人民醫(yī)院麻醉科，南京210029）

氯胺酮是常用靜脈麻醉藥，離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯胺酮能夠抑制巨噬細(xì)胞（AM）釋放炎性因子［1］，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。而脂多糖（LPS）是革蘭陰性菌外膜組成成分，侵入機(jī)體后在LPS結(jié)合蛋白介導(dǎo)下，與AM膜上CD14結(jié)合，通過(guò)核因子－κB（NF－κB）信號(hào)等途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞因子釋放和一氧化氮（NO）產(chǎn)生而參與炎癥反應(yīng)［2］。AM是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，AM通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子、自由基、蛋白酶及各種補(bǔ)體參與局部炎癥反應(yīng)［3］。本研究以肺泡AM系NR8383為研究對(duì)象，觀察氯胺酮對(duì)LPS刺激的總抗氧化能力（T－AOC）及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH－Px）的干預(yù)作用，初步探討氯胺酮對(duì)LPS誘發(fā)的氧化應(yīng)激作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料大鼠AM系NR8383（ATCC）、LPS （Sigma，美國(guó)）、鹽酸氯胺酮結(jié)晶粉末（KET，含量99.8%，批號(hào)05051112，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)）、Ham′s F－12培養(yǎng)液（hyclone，美國(guó)）、T－AOC和 GSH－Px測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）、胎牛血清（杭州四季青）、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（sunrise，澳大利亞）等。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將NR8383細(xì)胞株置于含15%胎牛血清、青霉素（100u/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）、L－谷胺酰胺（2mmol/L）、NaHCO3（1.5g/L）Ham′s F－12培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)上清液中 T－AOC和 GSH－Px的檢測(cè) 將大鼠AM按5×105個(gè)/mL接種于24孔板，每孔1mL。分為5組，對(duì)照組（C組）于培養(yǎng)基中加入與LPS等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）；LPS組（L組）于培養(yǎng)基中加入 LPS（1mg/L）；氯胺酮組（K1～3組）于培養(yǎng)基中加入氯胺酮 （終濃度分別為10、100、1 000μmol/L），孵育0.5h后，再加入LPS。培養(yǎng)24h后收集各組培養(yǎng)液，離心后取上清液，立即凍存于－20℃冰箱待測(cè)。上清液稀釋后按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以s表示。組間差異采用One－way ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

LPS刺激24h后NR8383細(xì)胞T－AOC和GSH－Px水平明顯降低（P＜0.01）。氯胺酮低濃度組（10μmol/L）與LPS組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而中、高濃度組（100、1 000μmol/L）能夠使LPS誘導(dǎo)的T－AOC和GSH－Px水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 各組T－AOC和GSH－Px水平檢測(cè)結(jié)果（u/mL，s）

表1 各組T－AOC和GSH－Px水平檢測(cè)結(jié)果（u/mL，s）

Δ：與對(duì)照組比較，P＜0.01；＊：與LPS組比較，P＜0.01。

T－AOC GSH－Px C組組別15.2±0.2 46.2±4.6 L組 7.3±0.5Δ 21.7±3.6△K1組 8.9±0.4 27.5±2.8 K2組 11.4±0.3＊ 34.1±6.1＊K3組 12.2±0.6＊ 38.7±3.5＊

3 討 論

AM是生物體抵御外來(lái)微生物入侵的天然屏障，是固有性免疫細(xì)胞中重要的效應(yīng)細(xì)胞。AM位于肺泡腔及小氣道內(nèi)，是肺內(nèi)重要的常駐細(xì)胞和防御細(xì)胞。除發(fā)揮吞噬防御功能外，也可通過(guò)分泌大量的細(xì)胞因子始動(dòng)和調(diào)節(jié)局部的炎癥反應(yīng)。在慢性阻塞性肺病、免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的肺損傷、哮喘等肺疾病中AM起著重要作用。AM還能被很多物質(zhì)激活，如LPS、H2O2、IFN－γ等，產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷。在哮喘研究模型中，目前多采用大鼠作實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，故本研究采用大鼠肺泡AM，選用具有正常肺泡AM特點(diǎn)的大鼠AM系NR8383作為研究對(duì)象，可連續(xù)傳代，不僅省時(shí)省力，而且還可以克服動(dòng)物個(gè)體差異導(dǎo)致的結(jié)果不穩(wěn)定性。NR8383細(xì)胞能提供研究肺泡AM適合的試驗(yàn)系統(tǒng)，能夠?qū)Υ碳ぎa(chǎn)生相應(yīng)的反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞因子等。

在激活狀態(tài)下，AM產(chǎn)生大量氧自由基，這些分子具有很高的反應(yīng)性，可以與細(xì)菌細(xì)胞膜、核酸分子及蛋白質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，導(dǎo)致抗氧化能力下降。此外活性氧（ROS）還可上調(diào)一些細(xì)胞因子及黏附分子，如TNF、IL－1、ICAM－1表達(dá)水平，放大炎癥反應(yīng)。

LPS是實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞激活藥物，其能夠激活細(xì)胞產(chǎn)生多種物質(zhì)。周媛等［3］發(fā)現(xiàn)LPS能夠使星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高及ROS釋放增加?，F(xiàn)已證實(shí)，LPS處理AM后可引起NF－кB途徑和 MAPK 途徑激活［4］。Zhou等［5］研究發(fā)現(xiàn)，在AM，LPS除了激活這兩種途徑外，還可引起胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，進(jìn)而激活 Protein kinase C （PKC），釋放 NO、TNF－α、ROS等。有研究顯示，用1mg/L LPS刺激肺泡AM，能夠引起NF－κB、cAMP、OH 和O2－明顯升高，使細(xì)胞處于激活狀態(tài)［6］。

T－AOC是體內(nèi)抗氧化物質(zhì)對(duì)抗過(guò)氧化損傷能力的總和，GSH－Px主要存在于胞漿和線粒體內(nèi)，能清除過(guò)氧化氫以及脂質(zhì)過(guò)氧化物。本研究結(jié)果表明，當(dāng)用LPS刺激AM后培養(yǎng)上清液中T－AOC和GSH－Px水平明顯降低，說(shuō)明LPS可以導(dǎo)致AM的抗氧化能力下降。

氯胺酮是目前常用麻醉藥物，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮除傳統(tǒng)的麻醉與鎮(zhèn)痛作用外，還具有明顯抗炎作用。譚志鑫和李玉山［7］通過(guò)失血性休克兔模型發(fā)現(xiàn)氯胺酮具有很好的抗氧化作用。有研究顯示，氯胺酮能明顯抑制嚴(yán)重創(chuàng)傷早期小鼠腹腔AM糖皮質(zhì)激素受體水平的下調(diào)，部分改善小鼠嚴(yán)重創(chuàng)傷誘發(fā)的應(yīng)激狀態(tài)［8－9］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，L組 T－AOC和 GSH－Px水平明顯低于C組，10μmol/L氯胺酮對(duì)此無(wú)改善作用，而當(dāng)用較高劑量范圍氯胺酮（100、1 000μmol/L）預(yù)處理時(shí)，對(duì) LPS所致的NR8383細(xì)胞T－AOC和GSH－Px水平降低具有明顯改善作用。Domino等［10］研究表明，氯胺酮100μmol/L為臨床用藥劑量，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，臨床劑量氯胺酮即可抑制LPS引起的氧化應(yīng)激損傷，增加氯胺酮?jiǎng)┝坎荒苓_(dá)到增加抑制效應(yīng)的目的。

綜上所述，臨床劑量氯胺酮即可抑制LPS引起的肺泡AM T－AOC和GSH－Px水平下降，而增加劑量不能增加抑制效果。

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